精噁唑禾草灵降解菌MEPE-0128的分离鉴定及水解酶的分离纯化

论文摘要

精噁唑禾草灵属于芳氧基苯氧基丙酸类除草剂,广泛应用于禾本科杂草防除,目前在我国应用范围很广。同其他农药一样,此类除草剂进入环境后对生物及生态环境会产生不良影响。本研究从长期受精噁唑禾草灵污染的土壤中分离筛选到了精噁唑禾草灵降解菌MEPE-0128,根据表型特征、生理生化特性和16SrRNA基因序列相似性分析,将其鉴定为Acinetobacter sp.。菌株MEPE-0128在pH 5.0-10.0范围内生长良好,当pH低于4.0菌株的生长明显受到抑制；生长温度范围较广,较低温度（20℃）对其生长也没有表现出明显的抑制作用；好氧性生长；MEPE-0128在NaCl浓度是0-10 g·L-1中可以生长,当NaCl浓度大于12 g·L-1时,菌体生长受到抑制；在以阿拉伯糖为碳源,以有机氮为氮源的培养基中生长良好；对红霉素敏感。菌株MEPE-0128能够在以精噁唑禾草灵为唯一碳源的无机盐培养基中生长,经过5 d的培养,能够降解80%以上的浓度为50 mg·L-1的精噁唑禾草灵。降解的最适温度为37℃,pH 4.0-10.0对降解没有显著的影响,随着pH值的降低,农药的水解率明显提高。起始浓度越高,所需的降解时间越长；降解速率与接种量成正相关；各种金属离子对农药的降解也没有促进或抑制作用。通过LC-MS技术研究了Acinetobacter sp.MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的代谢产物。在对代谢物结构的分析基础上推测了菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的代谢途径。结果表明菌株MEPE-0128在降解精噁唑禾草灵时,断裂酯键形成精噁唑禾草灵酸和乙醇。通过对精嗯唑禾草灵酸、6-氯苯并噁唑酮以及对羟基苯氧基丙酸这几种中间代谢产物降解菌的富集,发现富集液可以对三种代谢产物的降解达到90%以上,同时分离到了一株高效降解对羟基苯氧基丙酸的菌株MEPE-0129。菌株MEPE-0172是一株高效降解精噁唑禾草灵的红球菌,其粗酶液降解精噁唑禾草灵的最适反应温度为42℃,从25℃-42℃仍然留有约80%的酶活。最适pH值为8.0,pH值小于6.0,酶的活力急剧下降,在pH为4.0时,粗酶液的活力完全丧失,pH在7.0-9.0之间酶活基本稳定,Ag+对酶活有强烈的抑制作用。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析和Superdex-200层析,精嗯唑禾草灵水解酶的纯化倍数为369.5倍,比酶活达到21.5 U·mg-1,回收率为3%。通过酶谱分析及PAGE切胶回收SDS-PAGE分析,表明精嗯唑禾草灵酯酶分子量大约为42.3 kDa。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 1. 芳氧苯氧丙酸类除草剂
• 1.1 芳氧苯氧丙酸类除草剂的性质
• 1.2 芳氧苯氧丙酸类除草剂的作用机理
• 2. 除草剂精噁唑禾草灵
• 2.1 精噁唑禾草灵的基本特性
• 2.1.1 物理化学性质
• 2.1.2 精噁唑禾草灵的作用方式及使用特点
• 2.2 精噁唑禾草灵的生态毒性
• 2.3 精噁唑禾草灵的环境归宿
• 2.3.1 精噁唑禾草灵在植物体内的代谢
• 2.3.2 在动物体内的代谢
• 2.3.3 在水中的降解
• 2.3.4 在土壤中的降解
• 2.3.5 精噁唑禾草灵的光解
• 2.3.6 精噁唑禾草灵的微生物降解
• 2.4 精噁唑禾草灵及其代谢产物的检测方法
• 2.4.1 精噁唑禾草灵的检测
• 2.4.2 精噁哗禾草灵代谢产物的检测
• 2.5 酯酶的研究
• 2.5.1 微生物酯酶的研究进展
• 2.5.2 精噁唑禾草灵水解酶的研究
• 2.6 精噁唑禾草灵微生物降解研究存在的问题及本研究的意义
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章 精噁唑禾草灵降解菌的分离和鉴定
• 1. 材料和方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 试剂和土样
• 1.2 方法
• 1.2.1 精噁唑禾草灵降解菌的富集与分离
• 1.2.2 精噁唑禾草灵的检测方法
• 1.2.3 降解菌的培养特征及生理生化鉴定
• 1.2.4 降解菌的16S rDNA序列的PCR扩增及测序
• 1.2.5 降解菌系统发育地位的确定与系统发育关系的研究
• 2. 结果和分析
• 2.1 精噁唑禾草灵降解菌株的分离
• 2.2 菌株MEPE-0128的鉴定
• 2.3 环境条件对菌株MEPE-0128生长的影响
• 2.3.1 不同C源对菌株生长的影响
• 2.3.2 不同N源对菌株生长的影响
• 2.3.3 NaCl浓度对菌株生长的影响
• 2.3.4 温度对菌株生长的影响
• 2.3.5 pH值对菌株生长的影响
• 2.3.6 降解菌株MEPE-0128的最适C/N
• 2.3.7 菌株MEPE-0128对抗生素的耐受性
• 3. 本章小结
• 参考文献
• 第二章 精噁唑禾草灵降解菌株MEPE-0128降解特性及代谢途径的研究
• 第一节 菌株MEPE-0128对精噁唑禾草灵降解特性和代谢途径的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基和试剂
• 1.3 菌株MEPE-0128对精噁唑禾草灵的降解特性的研究
• 1.4 菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的代谢途径研究
• 1.5 精噁唑禾草灵中间代谢产物的检测方法
• 2. 结果与讨论
• 2.1 接种量对菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的影响
• 2.2 初始浓度对菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的影响
• 2.3 温度和pH值对菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的影响
• 2.4 金属离子对菌株MEPE-0128降解精噁唑禾草灵的影响
• 2.5 代谢产物积累的检测
• 2.6 产物的定性分析
• 2.7 代谢途径的推测
• 3. 本节小结
• 第二节 精噁唑禾草灵代谢产物降解菌的富集及菌株的筛选
• 1. 材料和方法
• 1.1 培养基
• 1.2 试剂
• 1.3 方法
• 2. 结果与讨论
• 2.1 精噁唑禾草灵酸降解菌的富集
• 2.2 6-氯苯并噁唑酮降解菌的富集
• 2.3 对羟基苯氧基丙酸降解菌的富集及单菌的筛选
• 3. 本节小结
• 参考文献
• 第三章 菌株MEPE-0172粗酶液降解精噁唑禾草灵特性的研究及水解酶的分离和纯化
• 第一节 菌株MEPE-0172粗酶液降解特性的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌株、培养基和试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验方法
• 1.4 粗酶液降解特性的研究
• 1.4.1 粗酶液的最适反应温度和热稳定性
• 1.4.2 粗酶液的最适pH值和酸碱稳定性
• 1.4.3 金属离子对粗酶液降解效率的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 实验菌株的选取
• 2.2 粗酶液的最适反应温度和温度稳定性
• 2.3 粗酶液的最适pH和酸碱稳定性
• 2.4 金属离子对粗酶液活力的影响
• 3. 本节小结
• 第二节 精噁唑禾草灵水解酶的分离和纯化
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌种、培养基和试剂
• 1.2 仪器设备
• 1.3 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 酯酶酶谱分析
• 2.2 精噁唑禾草灵水解酶的分离纯化
• 3. 本节小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本文创新之处
• 附录 文中所用试剂配方
• 致谢