抗虫基因cry2A~*对早粳稻的转化

论文摘要

黑龙江省是我国最大的优质粳稻产区,在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。自从1998年在黑龙江省哈尔滨地区的五常市稻田首次发现二化螟以来,螟虫有逐年加重危害和快速蔓延的势头,严重影响到水稻的产量。利用转基因技术培育抗虫水稻可以有效解决水稻虫害问题。本研究通过农杆菌介导的方法,利用可以进行转基因植物环境释放的bar基因作为选择标记,将经过密码子优化的、在单子叶ubi高效启动子调控下的、抗螟虫的Bt基因cry2A*转入具有代表性的黑龙江粳稻品种中,通过基因工程技术改良黑龙江粳稻对螟虫的抗性,创造适于寒区生态条件的抗虫转基因水稻材料,为黑龙江水稻实现少投入、多产出、保护生态环境的生产目标进行技术储备。本研究得到的主要结论如下:1、对目的基因cry2A*进行了酶切及PCR验证,结果表明用于转化的抗虫基因cry2A*准确无误,可以用于农杆菌介导的黑龙江水稻遗传转化工作。2、对农杆菌介导的、bar基因为筛选标记的北方粳稻遗传转化体系进行了优化。优化的遗传转化体系技术要点为成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织继代1次、愈伤组织预培养、农杆菌侵染愈伤组织10min、共培养、使用具有一定渗透势的清菌液清菌、在含PPT 15mg/L的筛选培养基上筛选抗性愈伤组织、预分化、抗性愈伤组织在含CN 250mg/L的分化培养基上再生成苗、转化苗生根、炼苗和移栽到土壤等。3、利用优化的农杆菌介导外源基因转化北方粳稻体系对空育131、松粳9号和松粳6号等黑龙江水稻品种进行了遗传转化工作。经过密码子优化的、ubi调控下的cry2A*基因转化空育131,获得了324块独立抗性愈伤,移栽成活30个抗性愈伤,共171棵转化苗;转化松粳9号,获得了11块独立抗性愈伤及5棵转化苗;转化松粳6号,获得了4块独立抗性愈伤,14棵转化苗。4、对水稻转化株T0代进行目的基因cry2A*的PCR检测,检测结果显示空育131阳性率为98.2%,松粳9号和松粳6号PCR检测呈阳性率100%,cry2A*基因已经整合到黑龙江水稻品种空育131、松粳9号和松粳6号核基因组中。5、转cry2A*基因水稻空育131的T1代PPT抗性筛选结果显示,大部分转基因植株插入了1个单拷贝的外源基因,或是多拷贝基因中只有1个具有表达功能,或多拷贝整合在1个位点。对抗PPT的转基因空育131进行了RT-PCR检测,初步证实了目的基因cry2A*在转基因水稻中得到表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白
• 1.1.1 苏云金芽孢杆菌简介
• 1.1.2 Bt 杀虫晶体蛋白及其基因的分类
• 1.1.3 Bt 杀虫晶体蛋白杀虫机理
• 1.1.4 转Bt 基因水稻研究概况
• 1.2 植物基因工程常用启动子
• 1.2.1 组成型启动子
• 1.2.2 组织特异性启动子
• 1.2.3 诱导型启动子
• 1.3 水稻转化常用筛选标记基因
• 1.3.1 nptⅡ
• 1.3.2 hpt
• 1.3.3 bar
• 1.4 密码子偏爱性及 Bt 基因密码子优化
• 1.4.1 密码子偏爱性
• 1.4.2 Bt 基因密码子优化
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 细菌菌株
• 2.3 基因、质粒和植物表达载体
• 2.4 试剂盒、主要试剂和仪器设备
• 2.4.1 试剂盒
• 2.4.2 主要试剂
• 2.4.3 主要仪器设备
• 2.5 培养基
• 2.5.1 细菌培养基
• 2.5.2 水稻遗传转化培养基
• 2.6 目的基因的验证
• 2.6.1 质粒DNA 的小量提取（碱裂解法）
• 2.6.2 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（电击法）
• 2.6.3 重组质粒酶切鉴定
• 2.6.4 重组质粒 PCR 验证
• 2.7 根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化体系及其优化
• 2.7.1 愈伤组织的诱导
• 2.7.2 愈伤组织的继代
• 2.7.3 愈伤组织的预培养
• 2.7.4 根瘤农杆菌的培养及处理
• 2.7.5 根瘤农杆菌侵染转化水稻愈伤组织及共培养
• 2.7.6 清菌和筛选
• 2.7.7 抗性愈伤的预分化与转基因植株的再生
• 2.7.8 遗传转化体系的优化
• 2.8 转化水稻的分子检测
• 0 代目的基因整合检测'>2.8.1 T₀代目的基因整合检测
• 1 代外源基因表达检测'>2.8.2 T₁代外源基因表达检测
• 第3章 结果与分析
• 3.1 目的基因的验证
• 3.1.1 酶切鉴定
• 3.1.2 PCR 验证
• 3.2 根瘤农杆菌介导的水稻遗传转化体系优化
• 3.2.1 不同基因型愈伤组织诱导率
• 3.2.2 愈伤组织继代次数对抗性愈伤的影响
• 3.2.3 侵染时间的确定
• 3.2.4 清菌方法及筛选培养基抑菌性抗生素浓度
• 3.2.5 PPT 有效筛选浓度
• 3.2.6 分化培养基抑菌抗生素浓度
• 3.3 转基因水稻植株的获得
• 0 代PCR 检测'>3.4 转基因植株T₀ 代PCR 检测
• 1 代株系外源基因表达'>3.5 转基因植株T₁代株系外源基因表达
• 3.5.1 bar 基因表达
• *基因表达的RT-PCR 检测'>3.5.2 cry2A^*基因表达的RT-PCR 检测
• 第4章 讨论
• *基因粳稻的意义'>4.1 农杆菌介导获得转cry2A^*基因粳稻的意义
• 4.2 农杆菌介导粳稻遗传转化体系的改进
• 4.3 提高外源基因表达的途径
• 4.4 筛选标记基因
• 1 代遗传规律分析'>4.5 T₁代遗传规律分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢