论文摘要
黑龙江省是我国最大的优质粳稻产区,在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。自从1998年在黑龙江省哈尔滨地区的五常市稻田首次发现二化螟以来,螟虫有逐年加重危害和快速蔓延的势头,严重影响到水稻的产量。利用转基因技术培育抗虫水稻可以有效解决水稻虫害问题。本研究通过农杆菌介导的方法,利用可以进行转基因植物环境释放的bar基因作为选择标记,将经过密码子优化的、在单子叶ubi高效启动子调控下的、抗螟虫的Bt基因cry2A*转入具有代表性的黑龙江粳稻品种中,通过基因工程技术改良黑龙江粳稻对螟虫的抗性,创造适于寒区生态条件的抗虫转基因水稻材料,为黑龙江水稻实现少投入、多产出、保护生态环境的生产目标进行技术储备。本研究得到的主要结论如下:1、对目的基因cry2A*进行了酶切及PCR验证,结果表明用于转化的抗虫基因cry2A*准确无误,可以用于农杆菌介导的黑龙江水稻遗传转化工作。2、对农杆菌介导的、bar基因为筛选标记的北方粳稻遗传转化体系进行了优化。优化的遗传转化体系技术要点为成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织继代1次、愈伤组织预培养、农杆菌侵染愈伤组织10min、共培养、使用具有一定渗透势的清菌液清菌、在含PPT 15mg/L的筛选培养基上筛选抗性愈伤组织、预分化、抗性愈伤组织在含CN 250mg/L的分化培养基上再生成苗、转化苗生根、炼苗和移栽到土壤等。3、利用优化的农杆菌介导外源基因转化北方粳稻体系对空育131、松粳9号和松粳6号等黑龙江水稻品种进行了遗传转化工作。经过密码子优化的、ubi调控下的cry2A*基因转化空育131,获得了324块独立抗性愈伤,移栽成活30个抗性愈伤,共171棵转化苗;转化松粳9号,获得了11块独立抗性愈伤及5棵转化苗;转化松粳6号,获得了4块独立抗性愈伤,14棵转化苗。4、对水稻转化株T0代进行目的基因cry2A*的PCR检测,检测结果显示空育131阳性率为98.2%,松粳9号和松粳6号PCR检测呈阳性率100%,cry2A*基因已经整合到黑龙江水稻品种空育131、松粳9号和松粳6号核基因组中。5、转cry2A*基因水稻空育131的T1代PPT抗性筛选结果显示,大部分转基因植株插入了1个单拷贝的外源基因,或是多拷贝基因中只有1个具有表达功能,或多拷贝整合在1个位点。对抗PPT的转基因空育131进行了RT-PCR检测,初步证实了目的基因cry2A*在转基因水稻中得到表达。
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