青霉素类药物族特异性抗体及IAC柱的制备

论文摘要

青霉素类药物是一类高效广谱抗生素,在兽医临床上广泛应用于治疗细菌感染引起的畜禽肠道、呼吸道等疾病。由于能引起人的过敏反应和容易诱导细菌产生耐药性等原因,致使许多国家对动物用青霉素类抗生素和在食品中的残留进行了严格监控。又因青霉素类抗生素使用范围广、使用量大,其在动物性食品中的残留令人关注。因此,建立高效、灵敏的青霉素类药物残留检测方法在动物源性食品安全方面具有非常重要的意义。本研究以青霉素类药物母核6-氨基青霉烷酸（6-APA）偶联牛血清蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）分别合成两种免疫抗原和包被抗原;制备的高效价的抗6-氨基青霉烷酸（6-APA）的抗血清经活性检测后被纯化;纯化的IgG偶联CNBr活化的Sepharose 4B制备免疫亲和层析柱（IAC）,初步测定了免疫亲和层析柱对青霉素G的柱容量及添加回收率。结果如下:1.青霉素类药物族特异性人工抗原的合成及鉴定采用戊二醛法,将6-氨基青霉烷酸（6-APA）分别与牛血清蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,分别制备免疫抗原6-APA-BSA和包被抗原6-APA-OVA。合成的人工抗原经紫外扫描和红外扫描鉴定表明6-APA与蛋白载体偶联成功,且经紫外光谱扫描法计算出6-APA-BSA、6-APA-OVA的半抗原结合比分别为13.53、8.25。2.青霉素类药物族特异性抗体的制备用6-APA-BSA常规免疫实验兔制备抗血清。建立检测青霉素药物族特异性抗血清效价的间接ELISA法,其中包被抗原6-APA-OVA工作浓度为5μg/ml,阴性血清的工作浓度为4000倍稀释,酶标二抗的最佳稀释倍数为10000倍稀释。利用建立的间接ELISA法检测抗体效价,制备的三个抗血清的效价分别为5.12×105、6.4×104、3.2×104。采用间接竞争ELISA法检测抗体的特异性。青霉素G、氨苄西林、邻氯西林、苯唑青霉素、阿莫西林的交叉反应率在13.5～101%之间,磺胺嘧啶钠、恩诺沙星、氯霉素、土霉素、林可霉素等非青霉素类抗菌药物的交叉反应率皆小于0.01%。说明抗血清族特异性良好;批内变异系数都在5.0%以内,批间变异系数都在10%以内。3.青霉素类药物族特异性IAC柱的制备及初步评价将制备的青霉素类药物族特异性抗血清通过硫酸铵粗提和DEAE-Sephadex A 50凝胶层析柱进一步纯化IgG,经10%PAGE-SDS电泳鉴定为目标蛋白。将所纯化蛋白与CNBr活化的Sepharose 4B琼脂糖偶联,偶联率为90.58%,装柱制备青霉素类药物族特异性IAC柱。采用HPCE检测方法对IAC柱柱效进行初步评价。建立青霉素G的HPCE检测标准曲线,青霉素G标准品浓度峰面积在1～100μg/mL范围内线性良好,标准曲线回归方程为y=468.66x -8.4299,R2=0.9971。峰面积日内、日间平均变异系数均低于4%;回收率在99.3～101.5%之间。IAC柱对青霉素G的动态柱容量为1433.8 ng ml-1·gel,绝对柱容量为24.42ng/mg IgG。在一星期内重复使用5次,青霉素G的动态柱容量仍能达到600 ng ml-1·gel,并且不影响使用。青霉素G样品添加回收率为94.67%～76.38%,变异系数5.67%～15.91%。淋洗液选用甲醇-乙腈-醋酸/醋酸钠缓冲液（60:25:15）为淋洗液。方法在准确度和精密度上均达到了残留分析的要求。

论文目录

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• 目录
• 本文常用英文缩写词
• 文献综述
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 常用缓冲液配制
• 2.2.2 青霉素类药物族特异性人工抗原的合成与鉴定
• 2.2.3 青霉素类药物族特异性抗体的制备及其检测
• 2.2.4 青霉素类药物族特异性抗血清的纯化及鉴定
• 2.2.5 青霉素类药物族特异性IAC装柱及其柱效评价
• 3 结果与分析
• 3.1 青霉素类药物族特异性人工抗原的合成与鉴定
• 3.1.1 青霉素类药物族特异性半抗原偶联基团的选择
• 3.1.2 青舞紊类药物族特异性人工抗原的鉴定
• 3.2 青霉素类药物族特异性抗体的制备及检测结果分析
• 3.2.1 青霉素类药物族特异性抗血清效价的测定结果
• 3.2.2 青霉素类药物族特异性抗血清交叉反应性的测定结果
• 3.3 青霉素类药物族特异性抗血清Ig G的凝胶层析法纯化及鉴定结果
• 3.3.1 饱和硫酸铁法粗提兔抗血清Ig G的蛋白的浓度
• 3.3.2 DEAE-Sephadex A50凝胶层析法纯化兔血清IgG蛋白浓度
• 3.3.3 DEAE-Sephadex A50凝胶层析法纯化兔血清IgG蛋白的纯化曲线
• 3.3.4 青霉素类药物族特异性抗血清IgG纯化鉴定
• 3.4 青霉素类药物族特异性IAC柱的制备及其柱效评价结果
• 3.4.1 青霉素类药物族特异性抗体IgG的偶联率结果
• 3.4.2 青霉素G的HPCE测定法的建立
• 3.4.3 免疫亲和层析柱对青霉素G柱容量与回收率的测定结果
• 4 讨论
• 4.1 青霉素类药物族特异性人工抗原的合成与鉴定
• 4.1.1 青霉素类族特异性人工抗原的制备
• 4.1.2 青霉素类药物族特异性人工抗原的鉴定
• 4.2 制备青霉素类族特异性抗体血清
• 4.3 ELISA检测方法的建立
• 4.4 青霉素类族特异性免疫亲和层析柱的制备
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读研期间发表的论文