长链非编码RNA HOTAIR调控p21WAF1/CIP1对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药性的研究

2020-12-30877 views

论文摘要

研究背景:肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均排在恶性肿瘤的首位。其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占原发性肺癌80%以上,超过60%的患者为中晚期,常失去手术机会,化疗是IIIb-IV期NSCLC的主要治疗手段。顺铂(DDP)仍然是NSCLC一线化疗方案中的重要组成药物,但其耐药性制约了其疗效的发挥。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)以RNA的形式在多种层面(表观遗传学、转录水平、转录后水平)上调控基因的表达,并在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。新近大量的研究报道lnc RNA HOTAIR在人类多种肿瘤中表达上调,并提示HOTAIR与肿瘤的发生发展、转移及预后有着密切的关系,但是其在肿瘤耐药中的作用机制尚不清楚。研究目的:探讨HOTAIR在人NSCLC顺铂耐药细胞中的表达及对DDP耐药性的影响,并探讨其作用机制。研究方法:(1)通过q RT-PCR检测HOTAIR在人NSCLC耐顺铂细胞株A549/DDP和亲本细胞株A549中的表达量差异。(2)A549/DDP细胞中转染HOTAIR的si RNA或si NC分子,外源性封闭HOTAIR并检测其转染效率。MTT实验检测DDP对耐顺铂细胞株A549/DDP、亲本细胞株A549及转染后A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)。流式细胞术、Hochest染色分析转染后A549/DDP细胞联合DDP处理的细胞凋亡与细胞周期分布。(3)分析HOTAIR可能的作用机制,Western blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,Bcl-xl和Bim)及周期相关蛋白(p21WAF1/CIP1)在耐顺铂细胞株A549/DDP/si NC+/-DDP、A549/DDP/si HOTAIR+/-DDP中的蛋白表达水平。(4)构建pc DNA3.1/p21WAF1/CIP1过表达载体转染入耐顺铂细胞株A549/DDP并通过q RT-PCR与Western blot检测其表达。MTT实验检测DDP对转染后A549/DDP细胞的IC50。流式细胞术分析转染后A549/DDP细胞联合DDP处理的细胞凋亡与细胞周期分布。(5)活体动物实验证实HOTAIR可通过调控p21WAF1/CIP1在A549/DDP耐药形成中发挥的重要作用,并分析抑制HOTAIR表达后对A549/DDP移植瘤生长的影响。(6)q RT-PCR及免疫组化分别检测HOTAIR和p21WAF1/CIP1在人肺腺癌DDP联合化疗敏感与不敏感组织中的表达水平差异,并分析两者的相关性。研究结果:本实验研究发现HOTAIR在人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中的表达量显著高于其亲本细胞A549细胞。另外,在A549/DDP细胞中干扰HOTAIR的表达后逆转了A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,提示HOTAIR在人肺腺癌细胞对DDP的耐药中发挥着重要作用。此外,干扰HOTAIR表达联合DDP处理后促进了细胞的凋亡,降低了细胞的增殖能力及细胞周期于G0/G1期阻滞增多。同时,Western Blot结果显示干扰HOTAIR表达能上调p21WAF1/CIP1的蛋白质表达水平,且研究发现p21WAF1/CIP1高表达后可以逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。在肺腺癌化疗敏感与不敏感组织标本中检测到HOTAIR与p21WAF1/CIP1的表达呈负相关。结论:体内外实验证实抑制HOTAIR表达可逆转非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞对DDP的耐药性,这一作用可能通过调控p21WAF1/CIP1来实现的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1. 前言
  • 2. 材料与方法
  • 1. 实验材料与仪器
  • 1.1. 细胞系
  • 1.2. 实验动物
  • 1.3. 肺腺癌组织标本
  • 1.4. 实验试剂
  • 1.5. 实验仪器
  • 2. 实验方法
  • 2.1. 细胞培养
  • 2.2. 总RNA的提取
  • 2.3. 实时定量PCR
  • 2.4. 蛋白质的提取与浓度测定
  • 2.5. 蛋白质免疫印迹(Western blot)
  • 2.6. 免疫组化
  • 2.7. 细胞转染siHOTAIR、siNC
  • WAF1/CIP1'>2.8. 细胞转染pc DNA3.1/ p21WAF1/CIP1
  • 2.9. G418筛选稳转细胞
  • 2.10. MTT法检测细胞增殖活力
  • 2.11. 流式细胞术检测细胞周期
  • 2.12. Hoechst 33258染色
  • 2.13. 流式细胞术检测细胞凋亡
  • 2.14. 裸鼠成瘤实验
  • 2.15. 数据处理
  • 3. 实验结果
  • 3.1. HOTAIR在人肺腺癌细胞系耐顺铂细胞株A549/DDP中的表达量显著上调
  • 3.2. 外源性封闭人肺腺癌细胞系耐顺铂细胞株A549/DDP中HOTAIR的表达
  • 3.3. HOTAIR对A549/DDP细胞的顺铂敏感性和细胞凋亡的影响
  • 3.4. HOTAIR对细胞增殖和细胞周期的影响
  • 3.5. HOTAIR调控肺腺癌细胞信号通路表达
  • 3.6. HOTAIR在活体水平影响A549/DDP细胞对顺铂的敏感性
  • 3.7. 上调p21表达可逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性
  • 3.8. HOTAIR与P21在肺腺癌组织中的表达水平呈负相关并与对顺铂的敏感性密切相关
  • 4. 讨论
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 附录(一) 综述
  • 参考文献
  • 附录(二) 缩略词表
  • 硕士期间发表及待发表文章
  • 致谢
  • 相关论文文献

    转载请注明:硕博论文网 » 长链非编码RNA HOTAIR调控p21WAF1/CIP1对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药性的研究

    上一篇
    下一篇

    相关文章