论文摘要
糖尿病胃肠动力障碍是糖尿病合并症在胃肠道的表现,糖尿病也是胃肠动力障碍的胃肠外最常见病因。据报道,糖尿病患者中无论是Ⅰ型还是Ⅱ型,约25%～55%患者有胃肠症状,如腹胀、上腹不适、腹痛、便秘等。糖尿病胃肠动力障碍严重影响患者的生活质量,但糖尿病所致胃肠动力障碍的机理仍不完全清楚。目前,国内外学者主要从自主神经病变、肠神经系统病变、高血糖对糖尿病胃动力的影响、Cajal间质细胞（intrstitial cells of Cajal,ICC）数量的改变以及胃平滑肌形态学改变等方面进行了研究。但也有学者认为糖尿病所致胃肠动力障碍的发病机理并非只有上述因素,细胞内的信号转导途径的改变可能在糖尿病胃肠动力障碍的发生发展中起重要作用。自从1981年de Bold等首次发现心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）以来,钠尿肽家族（natriuretic peptides,NPs）已有六大成员,即ANP、脑钠尿肽（brain natriuretic peptide,BNP）、C-型钠尿肽（C-type natriuretic peptide,CNP）、树眼镜蛇性钠尿肽（dendroaspis natriuretic peptide,DNP）、室性钠尿肽（ventricularnatriuretic peptide,VNP）、和珊瑚毒蛇性钠尿肽（micrurus natriuretic peptide,MNP）。NPs通过与细胞膜上的钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor,NPR）结合而发挥其生物学作用。NPs和NPR在机体内分布比较广泛,NPs共有的效应是利尿、排钠、舒张血管、降低血压和调节水电解质平衡等。NPR有三种类型:NPR-A、NPR-B、NPR-C。其中NPR-A、NPR-B是与颗粒性（膜结合性）鸟苷酸环化酶（particulate guanylate cyclase,pGC）耦联的单次跨膜蛋白,NPs和这两种受体结合可以激活受体本身的鸟苷酸环化酶（guanylatecyclase,GC）活性,使三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate,GTP）环化,生成环—磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）,cGMP再激活cGMP依赖的蛋白激酶G（cGMP dependent protein kinase,PKG）发挥生理效应。不同NP和各种NPR的亲和力不同,表现出受体结合的相对选择性。ANP、BNP主要和NPR-A结合,CNP主要和NPR-B结合,通过NPR-A生成cGMP的能力依次为ANP≥BNP＞CNP,通过NPR-B生成cGMP的能力依次为CNP＞ANP＞BNP。我们以往的研究结果表明,胃肠道也有NP及NPR分布,NPR在胃窦平滑肌分布最多,并对豚鼠、大鼠和人胃平滑肌的自发性活动均起着抑制性调节;NPs抑制胃平滑肌的作用机制是通过NP-NPR-B-pGC-cGMP信号转导途径,生成的第二信使cGMP激活三磷酸肌醇介导的钙释放(IP3-induced Ca2+ release,IICR)途径使细胞内钙库释放钙,进而激活钙敏感钾通道（calcium-activated potassiumcurrents,IK（Ca））,使Ca2+外流,膜电位超极化,最终导致平滑肌舒张;NPs中CNP对胃平滑肌自发性收缩的作用强于ANP和BNP。一些学者报导,在链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导糖尿病模型动物肾和血管等器官,CNP mRNA或NPR-B mRNA表达增强。但在糖尿病胃动力障碍中CNP-NPR-B-pGC-cGMP信号转导途径作用的研究尚未见报导。因此,本研究利用离体肌条实验、免疫组织化学、放射免疫分析、RT-PCR等技术,用STZ制备糖尿病动物模型,探讨了糖尿病大鼠胃动力障碍中CNP-cGMP信号转导途径的作用。实验结果如下:1.以腹腔注射STZ方法制备糖尿病大鼠模型,4周后用于实验。在整个实验过程中注射STZ大鼠均处于高血糖状态。糖尿病组大鼠血糖浓度明显高于正常对照组大鼠,分别为478.0±27.9mg/dl和108.9±11.4mg/dl（n=8,P＜0.001）;糖尿病组大鼠体重明显低于正常对照组大鼠,分别为209.7±8.0g和247.4±13.1g（n=8,P＜0.05）;糖尿病组大鼠尿量明显多于正常对照组大鼠,分别为145.0±8.0ml/d和15.2±1.2ml/d（n=8,P＜0.001）。2.在我们的实验条件下,正常对照组大鼠胃窦环行平滑肌自发性收缩活动频率为3.1±0.14次/min,而发病4周的糖尿病组大鼠胃窦环行平滑肌自发性收缩活动频率为2.23±0.13次/min,明显低于正常对照组大鼠（n=8,P＜0.01）,而且收缩节律紊乱。但糖尿病组大鼠胃窦平滑肌收缩振幅与正常对照组大鼠比较没有明显差异,其收缩力分别为115.18±8.69和109.34±6.54（n=8,P＞0.05）。3.CNP剂量依赖性地（0.01μmol/L、0.03μmol/L和0.1μmol/L）抑制正常对照组及糖尿病组大鼠胃窦平滑肌的收缩,降低其收缩振幅,其抑制程度在正常对照组大鼠分别为20.5±1.5%、31.1±1.7%和58.9±3.7%,而在糖尿病组大鼠分别为25.5±1.7%、43.64±3.2%和85.14±2.5%（n=6,P＜0.05）;0.1μmol/L的CNP对正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌收缩频率的抑制程度分别为26.95±2.82%和53.334±2.03%（n=8,P＜0.01）,收缩活动完全被抑制时间分别为1.43±0.80min和8.954±2.07min（n=8,P＜0.01）。结果提示,糖尿病组大鼠胃窦平滑肌对CNP的敏感性明显高于正常对照组大鼠。4.胃窦平滑肌灌流装置中预处理0.1μmol/L CNP后,检测胃窦平滑肌组织cGMP生成量。正常对照组大鼠胃窦平滑肌cGMP生成量为2.70·0.32 pmol/mg.protein,而糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织cGMP生成量为4.42·0.22 pmol/mg.protein,明显高于正常对照组大鼠（n=8,P＜0.05）。5.利用放射免疫分析技术,测定胃窦平滑肌细胞膜经0.1μmol/L CNP预处理后,生成的cGMP量来检测pGC活性。结果,处理CNP之前,正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌细胞膜cGMP生成量分别为0.74±9 pmol/mg.protein/min和0.89±13 pmol/mg.protein/min（n=6,P＞0.05）。在经CNP处理之后,正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌细胞膜cGMP生成量分别为3.22±32 pmol/mg.protein/min和5.92±23 pmol/mg.protein/min,糖尿病组大鼠胃窦平滑肌细胞膜cGMP生成量远高于正常对照组大鼠（n=8,P＜0.01）,表明糖尿病组大鼠胃窦平滑肌细胞膜的pGC活性明显增强。6.利用免疫组织化学技术观察了NPR-B蛋白在大鼠胃窦平滑肌组织中的表达。结果:正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织NPR-B蛋白均呈阳性,可观察到散在分布的棕色颗粒,其显色指数分别为17.63±1.49%和30.67±1.59%,糖尿病组大鼠的NPR-B蛋白表达明显高于正常对照组大鼠（n=9,P＜0.01）。接着利用RT-PCR技术,进一步观察了NPR-B mRNA在大鼠胃窦平滑肌组织中的表达,结果:正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织NPR-B mRNA表达光密度值分别为0.13±0.03和0.34±0.10,糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织中NPR-BmRNA表达明显高于正常对照组大鼠（n=3,P＜0.01）。7.利用免疫组织化学技术观察到,在正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织中CNP阳性表达主要见于肌层,环行肌和纵行肌均有散在分布的棕色颗粒。正常对照组和糖尿病组大鼠胃窦平滑肌组织中CNP阳性表达显色指数分别为41.26±0.71%和41.71±0.21%,两者之间尚无明显差异（n=9,P＞0.05）。以上结果提示:1.STZ诱导糖尿病大鼠发病4周后,胃窦平滑肌自发性收缩活动开始出现异常,主要表现为收缩活动频率减慢和收缩节律紊乱,但收缩振幅不受明显的影响;2.STZ诱导糖尿病大鼠发病4周后,胃窦平滑肌CNP-cGMP信号转导途径的活性明显提高,主要与NPR-B上调及平滑肌细胞膜pGC活性增强有关;3.STZ诱导糖尿病大鼠发病4周后,胃窦平滑肌组织CNP含量并无明显的改变;4.CNP-NPR-B-pGC-cGMP信号转导途径很可能在糖尿病大鼠胃动力障碍的发生过程中起重要作用。本研究首次在糖尿病动物模型上证实了糖尿病大鼠胃窦平滑肌组织CNP-NPR-B-pGC-cGMP信号转导途径上调的事实,阐明了糖尿病胃动力障碍发生过程中CNP-NPR-B-pGC-cGMP信号转导途径的重要作用。这项研究结果对研究糖尿病胃动力障碍的发病机理具有重要的理论意义,同时为防治糖尿病胃动力障碍提供了重要的实验依据。