论文题目: 巴西橡胶树死皮机制的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 吴坤鑫
导师: 陈守才
关键词: 巴西橡胶树,死皮病,程序性细胞死亡,机制
文献来源: 华南热带农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 天然橡胶是重要战略物资和工业原料,而橡胶树“死皮”危害巨大,是产业发展的限制因子,因此研究和阐明橡胶树死皮发生的机制,具有重大的理论和实际意义。在前期工作中,我们已经通过DDRT-PCR技术鉴定和克隆到了一个和死皮抗性相关的基因,命名为HbMyb1。对HbMyb1的表达分析结果可知,在橡胶树中,死皮越严重,离病灶越近的部分,HbMyb1的表达就越低,反之就越高(Chen,etal.,2003)。PSORT蛋白质定位信号分析提示,HbMyb1基因表达产物有可能是核蛋白。结构分析和构象预测表明,HbMyb1有HTH DNA结合域,且具有多个磷酸化位点。说明HbMyb1产物可能是一个转录因子。而且,HbMyb1产物和拟南芥类myb基因相关的转录激活因子同源性高达59%,而myb类基因具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能。同时,电镜观察结果发现死皮树乳管细胞核染色质有凝聚现象。据此,我们提出“橡胶树死皮可能是细胞凋亡的新现象,HbMyb1可能是细胞凋亡的负调控因子”的新观点。本研究正是沿着这一思路设计一套系统有效的方法来证实上述观点,以揭示多年以来全世界在该领域苦苦探索的橡胶树死皮发生和发展的奥秘。 为验证橡胶树死皮是一种植物细胞凋亡的现象,我们首先分别提取橡胶树无性系PR107和RRIM600健康树、死皮树的树皮DNA,并用1.5%琼脂糖胶进行电泳分析。结果表明死皮树树皮DNA均呈典型的DNA梯度条带(DNA ladder),而健康树树皮DNA呈完整的一条带(图1)。对于坏死细胞而言,基因组DNA降解随机发生,在电泳胶上只能检测到连续分布的DNA条带。对于PCD细胞而言,基因组DNA降解并不是随机发生,在电泳胶上出现的是长度为180～200bp倍数的梯状条带(DNA ladder),这是一种专一核酸内切酶降解核小体间DNA的结果。因此,梯状条带的存在与否是区分PCD与坏死的标准之一。我们从橡胶死皮树的树皮提取的DNA电泳结果存在典型的DNA梯状条带(图1),说明橡胶树死皮是一种植物细胞凋亡的现象。 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling reaction,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记反应)是一种检测DNA片段3′末端羟基的方法。在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导下,荧光素—12-dUTP
论文目录:
1 前言
1.1 橡胶树形态及生理学
1.2 橡胶树死皮病研究
1.3 植物程序性细胞死亡(PCD)研究进展
1.3.1 植物中细胞凋亡现象的普遍存在
1.3.2 植物细胞凋亡的调节
1.3.3 与植物细胞凋亡相关的蛋白酶
1.3.4 与植物细胞凋亡相关的基因
1.4 植物MYB类转录因子研究进展
1.4.1 MYB类转录因子
1.4.2 植物MYB类转录因子家族
1.4.3 MYB类转录因子在植物体内具有广泛的生物学功能
1.4.4 植物体内MYB基因活性的调节
1.4.5 植物中myb基因的进化
1.5 本研究的目的和意义
1.6 本研究的技术路线
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及质粒
2.1.3 主要生化试剂
2.2 方法
2.2.1 HbMyb1基因植物表达载体的构建
2.2.2 HbMyb1启动子控制的系列缺失植物表达载体的构建
2.2.3 三亲交配法转化农杆菌
2.2.4 农杆菌介导的烟草遗传转化
2.2.5 转化植株的DNA提取(CTAB法)
2.2.6 转基因植株的PCR鉴定
2.2.7 Southern检测(按照Roche公司试剂盒说明书)
2.2.8 转基因烟草的RT-PCR检测
2.2.9 转基因烟草RNA提取和完整性、均一性分析(CTAB法)
2.2.10 Northern检测(按照Roche公司试剂盒说明书)
2.2.11 转基因烟草抗除草剂paraquat实验
2.2.12 转基因烟草接种烟草灰霉菌实验
2.2.13 转基因烟草紫外照射实验
2.2.14 不同激素刺激对胶乳HbMyb1表达的影响
2.2.15 橡胶树树皮DNA的提取(CTAB法)
2.2.16 橡胶树树皮TUNEL检测
2.2.17 嵌合载体在橡胶树胶乳中瞬时表达的研究
2.2.18 GFP基因Western blot检测
3 结果与分析
3.1 橡胶树树皮DNA分析
3.2 橡胶树乳管TUNEL检测
3.3 HbMyb1转基因烟草鉴定模型的建立
3.4 T_1代转基因烟草除草剂抗性分析
3.5 T_1代转基因烟草灰霉菌抗性分析
3.6 T_1代转基因烟草紫外照射抗性分析
3.7 不同激素刺激对胶乳HbMyb1表达的影响
3.7.1 乙烯利刺激对胶乳HbMyb1表达的影响
3.7.2 茉莉酸刺激对胶乳HbMyb1表达的影响
3.7.3 水杨酸刺激对胶乳HbMyb1表达的影响
3.8 HbMyb1上游调控序列功能序列的鉴定
3.8.1 GFP为报告基因的HbMyb1上游调控序列缺失表达载体的构建
3.8.2 缺失序列表达载体pCAMBIA1302/P1、pCAMBIA1302/P2、pCAMBIA1302/P3在橡胶树胶乳中的瞬时表达
3.8.3 缺失序列表达载体pCAMBIA1302/P1、pCAMBIA1302/P2、pCAMBIA1302/P3在烟草中的表达研究
4 讨论
4.1 橡胶死皮是一种植物细胞凋亡的新表现
(1) 橡胶死皮树树皮出现典型的DNA梯状条带
(2) 橡胶死皮树乳管细胞TUNEL检测呈阳性
4.2 HbMyb1是PCD负调控因子
4.3 不同激素处理对胶乳HbMyb1表达的影响
4.4 HbMyb1上游调控序列功能序列的鉴定
5 结论
参考文献
缩写词及其英汉对照
附录
彩版Ⅰ
彩版Ⅱ
作者简历
致谢
发布时间: 2005-07-27
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