黄曲霉拮抗菌分离鉴定、培养条件优化及其发酵上清液部分特性初步研究

论文摘要

黄曲霉（Aspergillus flavas）属于曲霉属真菌,普遍通过产生孢子进行传播,侵染植物及植物产品、各种食品和饲料等。黄曲霉最大的危害是产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素（AFT）是粮油食品中常出现的黄曲霉（Aspergillus flavas Link）和寄生曲霉（Aspergillus Parasiticas Speave）产生的一种具活性的、有毒的次级代谢产物。黄曲霉毒素属于极毒,对人、畜肝脏的剧烈损害而名列毒性之首,危害极大。黄曲霉和AFT防治工作在食品安全卫生控制中意义重大。对黄曲霉及其毒素的防治,目前国内外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代谢产物来获得具有抗菌或降解毒素特性的物质。本研究旨在分离筛选出对黄曲霉生长有抑制效果的拮抗细菌,开展最佳培养条件的优化和发酵上清液相关性质的研究,利用拮抗菌发酵上清液来达到黄曲霉及其毒素防治的效果。研究结果如下：（1）通过稀释分离法从土壤中分离纯化出一株具有黄曲霉拮抗活性的菌株,该菌株的发酵上清液具有抑制黄曲霉生长的效果,抑菌率达37.88%。根据形态学观察、生理生化反应和16S rDNA鉴定该菌株为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。（2）采用单因素实验得出每个培养条件的最优水平。通过PB设计,从蛋白胨、乳糖、硫酸锰（Mn2+）、L-半胱氨酸盐酸盐、培养基初始pH值、装液量、接种量、培养温度、摇床转速、培养时间等10个因素中筛选出3个主要影响因素,分别为蛋白胨、pH、L-半胱氨酸盐酸盐,其他因素影响不显著。然后结合中心组分旋转设计及响应面分析确定了主要因素的最优水平,分别为蛋白胨浓度2.15%,L-半胱氨酸盐酸盐0.055g/L,pH为7.75,在乳糖浓度为2%,接种量2%,装液量30mL,于30℃,190r/min的转速振荡培养90h,此时实测抑菌率为56.30%,接近预测值55.71%。（3）本文初步研究了萎缩芽孢杆菌发酵上清液中的抑菌谱、蛋白浓度、相当于山梨酸钾抑菌效果和发酵上清液对温度、酸碱度、蛋白酶的耐受能力等特性。结果表明,该菌对桃褐腐病菌、禾谷镰刀菌、土豆早疫病菌等多种病原真菌抑制效果明显,具有广谱抑菌效果。每1毫升上清液中含有0.5694mg蛋白质,1mL上清液中含有的抑菌物质相当于0.013g山梨酸钾。拮抗细菌发酵上清液对温度和pH耐受力较好,木瓜蛋白酶能降解其中部分抑菌物质,但未能使之完全失活。（4）本文初步探讨了拮抗菌在玉米、花生、大豆、大米等食品模型上对黄曲霉的生长和产毒的抑制效果。采用拮抗菌培养上清液与浓度为1×107CFU的菌悬液,各按照2、3、4m1的量,与100μL黄曲霉孢子悬液（1×105个/mL）接种至各种粮食表面；30℃恒温培养,5d后观察黄曲霉生长情况。选取各组中没有黄曲霉生长的实验组,采用胶体金试纸测定其中AFB1含量,结果均显示阴性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 黄曲霉及其毒素危害
• 1.2 黄曲霉防治研究现状
• 1.2.1 黄曲霉生物防治研究现状
• 1.2.2 黄曲霉其他防治方法现状
• 1.3 芽孢杆菌抗菌应用研究现状
• 1.4 培养条件优化
• 1.5 本研究目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 供试菌株
• 2.2 主要仪器及试剂
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 黄曲霉拮抗菌初筛
• 2.3.2 黄曲霉拮抗菌复筛
• 2.3.3 拮抗菌鉴定
• 2.3.4 绘制拮抗菌的生长曲线
• 2.3.5 测定拮抗菌的抑菌谱
• 2.3.6 培养条件优化
• 2.3.7 拮抗菌的拮抗机理探讨及产物粗提取
• 2.3.8 发酵上清液部分特性
• 2.3.9 拮抗菌应用于几种粮食贮藏
• 3 结果与分析
• 3.1 黄曲霉拮抗菌筛选及鉴定
• 3.1.1 黄曲霉拮抗菌初筛
• 3.1.2 黄曲霉拮抗菌复筛
• 3.1.3 拮抗菌鉴定
• 3.1.4 绘制拮抗菌的生长曲线
• 3.1.5 测定拮抗菌的抑菌谱
• 3.2 培养条件优化
• 3.2.1 培养基成分确定
• 3.2.2 单因素实验
• 3.2.3 Plackeet-Burman设计实验结果
• 3.2.4 中心组分旋转设计结果
• 3.2.5 效果验证实验
• 3.3 拮抗机理及粗提产物生物学特性
• 3.3.1 拮抗机理初步探讨
• 3.3.2 产物粗提取
• 3.3.3 粗提产物对温度,pH,蛋白酶敏感性
• 3.3.4 粗提产物中蛋白类物质含量
• 3.3.5 发酵上清液的抗菌效力
• 3.4 拮抗菌应用于几种粮食贮藏
• 4 结论与讨论
• 4.1 拮抗菌筛选鉴定
• 4.2 培养条件优化
• 4.3 拮抗菌发酵上清液部分特性
• 4.4 拮抗菌应用于粮食贮藏
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录