反义抑制环阿乔醇合成酶基因对人参发根皂苷合成的影响

论文摘要

人参皂苷是人参的主要药理活性物质。研究表明,人参皂苷的前体为2,3-氧化角鲨烯,人参中2,3-氧化角鲨烯分别流向人参皂苷和固醇两条支路。环阿乔醇合成酶（CS）和达玛烯二醇合成酶（DS）分别是控制2,3-氧化角鲨烯流向植物固醇和人参皂苷合成途径的关键酶。环阿乔醇合成酶催化2,3-氧化角鲨烯生成环阿乔醇,环阿乔醇经一系列生化反应生成植物固醇。达玛烯二醇合成酶催化2,3-氧化角鲨烯生成达玛烯二醇,达玛烯二醇经一系列生化反应生成人参皂苷。本研究通过反义RNA技术抑制了人参发根CS的表达,使代谢流主要流向人参皂苷,从而达到提高人参皂苷含量的目的。本文首先利用RT-PCR方法从人参总RNA中扩增出901bp的CS基因片段,并把此片段插入到pMD18-T载体上,进而克隆到大肠杆菌JM109中。然后,把CS基因片段以反义方向亚克隆到植物表达载体pBI121中,并转化发根农杆菌A4。利用阳性发根农杆菌A4侵染3年生的人参根片,获得表达反义CS的人参发根。Northern blot分析表明,反义CS发根能表达大量的反义CS-RNA,其正义CS-RNA水平降低。同时,反义CS人参发根的固醇合成水平降低,而人参皂苷含量提高。进一步深入研究表明反义CS人参发根的CS酶活性有所降低,而DS酶活性得到提高。此外,反义发根系早期的2,3-氧化角鲨烯水平也有所提高。

论文目录

• 内容提要
• 第1章 绪论
• 1.1 选题的目的和意义
• 1.2 研究内容
• 1.3 采用的研究方法和技术路线
• 1.3.1 研究方法
• 1.3.2 技术路线
• 1.4 本研究的特色和创新之处
• 第2章 人参、发根及反义RNA 技术概述
• 2.1 人参
• 2.1.1 人参分布及市场
• 2.1.2 人参产品
• 2.2 人参皂苷
• 2.2.1 人参皂苷的药理活性
• 2.2.2 人参皂苷的结构分类及命名
• 2.2.3 人参皂苷的生物合成途径
• 2.2.4 人参皂苷的提取纯化和测定
• 2.2.5 人参皂苷的生物转化
• 2.3 人参细胞、组织及发根培养
• 2.4 植物发根研究进展
• 2.4.1 发根诱导
• 2.4.2 发根植株再生
• 2.4.3 发根次级代谢产物生产
• 2.4.4 发根基因工程
• 2.4.5 发根的其它用途
• 2.4.6 发根的大规模培养
• 2.5 反义RNA 技术
• 2.5.1 反义RNA 在生物体内的作用机制
• 2.5.2 反义 RNA 技术
• 2.5.3 反义RNA 技术在植物领域的应用
• 第3章 人参CS 基因片段的克隆
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料及仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 培养基及试剂的配制
• 3.3.2 人参发根的培养和菌株的低温保存
• 3.3.3 人参发根总 RNA 的提取
• 3.3.4 RT-PCR 及目的产物回收
• 3.3.5 感受态大肠杆菌制备
• 3.3.6 克隆载体重组、转化和鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 总 RNA 的提取
• 3.4.2 PCR 扩增及目的片段的回收
• 3.4.3 目的DNA 片段的克隆和酶切鉴定
• 3.5 本章小结
• 第4章 CS 基因反义表达载体构建及发根农杆菌 A4 的转化
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种及试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 培养基及试剂配制
• 4.2.4 CS 反义表达载体构建方法
• 4.2.5 菌种的活化
• 4.2.6 质粒pBI121 和 CS-pMD18-T 的提取
• 4.2.7 反义表达载体构建和发根农杆菌A4 的转化
• 4.2.8 发根农杆菌A4 阳性克隆的鉴定
• 4.2.9 发根农杆菌A4 阳性克隆的保藏
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 pBI121 载体 DNA 和目的片段 DNA 的制备
• 4.3.2 连接、转化及农杆菌A4 阳性克隆的筛选
• 4.4 本章小结
• 第5章 反义CS 发根体系的建立
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 植物材料、菌种和试剂
• 5.2.2 仪器
• 5.2.3 培养基及试剂配制
• 5.2.4 转化用发根农杆菌的菌液制备
• 5.2.5 人参发根诱导
• 5.2.6 诱导出的人参发根的除菌
• 5.2.7 杂交探针制备
• 5.2.8 人参发根 Northern 印迹分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 反义CS 人参发根体系的建立
• 5.3.2 Northern 杂交分析
• 5.4 本章小结
• 第6章 反义CS 人参发根的生长和皂苷合成
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 试剂
• 6.2.2 仪器
• 6.2.3 培养基及试剂配制
• 6.2.4 人参发根生长曲线测定
• 6.2.5 人参发根总皂苷提取及测定
• 6.2.6 DS 和CS 酶活性分析
• 6.2.7 2,3-氧化角沙烯含量分析
• 6.2.8 人参发根植物固醇含量分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 反义CS 人参发根的生长和形态变化
• 6.3.2 反义CS 人参发根皂苷含量分析
• 6.3.3 人参发根植物固醇含量分析
• 6.3.4 发根DS、CS 酶活和2,3-氧化角沙烯含量分析
• 6.4 本章小结
• 第7章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT