嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因的DNA改组及酶学性质的研究

论文摘要

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源。纤维素的利用与转化对于解决目前世界所面临的粮食短缺、环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。纤维素酶可以将纤维素水解成为葡萄糖,这是一条无污染且能有效利用纤维素的途径。但目前纤维素酶的成本仍较高,一些纤维素酶具有活性较低或热稳定性较差等缺点,通过定向进化可以不断提高并获得新性能的重组纤维素酶。本试验以嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因egⅠ为研究对象,通过DNA改组技术对野生型egⅠ进行突变重组,以期获得高内切葡聚糖酶活性、高稳定性的突变菌株。本研究主要结果:1.通过优化DNaseⅠ酶切时间、无引物PCR和有引物PCR的模板量等关键因素,建立适合于嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因改组的条件。2.以质粒pMD-18T-egⅠ为模板进行PCR扩增,获得野生型egⅠ,利用DNA shuffling技术,得到大约400个突变克隆,随机挑选20株进行测序和序列分析,突变率达0.11%0.43%。3.将含有突变基因的重组质粒pMD-18T- egⅠ和酵母表达质粒pPIC9K用SnaBⅠ、NotⅠ进行双酶切,经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α,抽提质粒,获得携带不同片段的质粒。线性化后,采用LiCl转化方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,MD平板上筛选Mut+His+转化子。阳性转化子在基础盐培养基中诱导表达,经酶活测定,筛选出1株活性较高的菌株BY2,酶活为23.75 U/mL,比出发菌株酶活提高了将近10倍。4.为得到高表达基因工程菌株,提取这株突变菌的基因组,以EG-S和EG-A为引物扩增该突变基因,序列分析发现该突变株为13号突变基因。突变基因与pPIC9K连接,线性化后进行电击转化。通过活性筛选,得到高活性突变体BY213,在基础盐培养基中培养168h后,酶活可达到78.63U/ml,蛋白含量达到1.14mg/mL。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,分子量为34.1KDa。5.研究了BY213菌株的内切葡聚糖酶酶学性质,其最适反应温度为65℃,最适pH值为3.5,在pH2.54.0仍表现出90%以上的酶活;55℃保温30min,酶活保持85%以上,但在pH2.58.5范围内稳定性较低,仅保留40%65%的原酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 本研究的目的和意义
• 1.2 纤维素酶的概述
• 1.2.1 纤维素酶的来源
• 1.2.2 纤维素酶的组成和作用机理
• 1.2.3 纤维素酶的酶活测定
• 1.2.4 纤维素酶的分子生物学进展
• 1.2.5 纤维素酶的应用
• 1.2.6 纤维素酶的研究现状、存在的问题及研究趋势
• 1.3 DNA 改组技术简介
• 1.3.1 DNA 改组技术的原理及步骤
• 1.3.2 DNA 改组技术的发展
• 1.3.3 DNA 改组技术的优点及局限性
• 1.3.4 DNA 改组技术的应用及展望
• 1.4 本研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与生化试剂
• 2.1.3 培养基与相关溶液的配制
• 2.1.4 主要设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 嗜热子囊菌EGⅠ基因的扩增
• 2.2.3 扩增产物的回收
• 2.2.4 DNA 改组
• 2.2.5 克隆载体的构建
• 2.2.6 感受态细胞的制备
• 2.2.7 克隆载体的转化
• 2.2.8 质粒DNA 的小量抽提
• 2.2.9 阳性克隆的筛选与鉴定
• 2.2.10 纤维素酶基因的测序与分析
• 2.2.11 表达载体的构建
• 2.2.12 毕赤酵母细胞的转化
• 2.2.13 酵母基因组DNA 的提取
• 2.2.14 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.15 重组蛋白的SDS-PAGE 电泳分析
• 2.2.16 酶活力的测定
• 2.2.17 可溶性蛋白的测定
• 2.2.18 酶学性质的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 内切葡聚糖酶EGⅠ基因改组
• 3.1.1 目的基因的扩增
• 3.1.2 DNaseⅠ酶切
• 3.1.3 无引物PCR
• 3.1.4 有引物PCR
• 3.2 转化子的筛选与鉴定
• 3.3 突变基因库的测序与分析
• 3.4 表达载体的构建
• 3.5 突变株的筛选
• 3.6 高表达毕赤酵母基因工程菌的构建
• 3.6.1 转化子的小体系诱导表达
• 3.6.2 重组毕赤酵母的摇瓶诱导
• 3.6.3 SDS-PAGE 分析
• 3.7 酶学性质的研究
• 3.7.1 最适温度及温度稳定性
• 3.7.2 最适pH 及pH 稳定性
• 4 讨论
• 4.1 DNA 改组的条件
• 4.1.1 DNA shuffling 突变率的控制
• 4.1.2 模板浓度的控制
• 4.2 突变株的筛选
• 4.3 纤维素酶的构效关系
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢