牛雄性生殖干细胞分离培养特性及移植研究

论文摘要

雄性生殖干细胞（male germ stem cells, mGSCs）是性腺分化开始一直存在于睾丸曲细精管中、唯一能将遗传物质传递给后代的干细胞。在mGSCs的细胞学特性、分离纯化方法、体外长期培养系统、体外诱导mGSCs形成单倍体细胞和精子、mGSCs的基因修饰和同种异种间的移植等方面,许多研究者做了许多工作,新的成就不断涌现,但是关于哺乳动物mGSCs的研究,仍然处于起步探索阶段。本试验在前人研究的基础上,分析牛性腺发育和曲细精管中mGSCs的分布规律;以新生牛睾丸为材料,比较不同mGSCs分离纯化的方法及效果;不同饲养层细胞和细胞因子对体外培养新生牛mGSCs行为的影响;新生牛ES-mGSCs的形成及体外分化潜能;定向诱导新生牛mGSCs体外形成精子样细胞;新生牛mGSCs移植无内源性生殖细胞模型兔睾丸,探讨新生牛mGSCs异种移植的可行性。mGSCs来源于PGCs,观察不同发育阶段牛性腺组织结构显示,610 w牛胎儿,性腺开始分化,雄性生殖细胞开始克隆聚集;15 w胎牛形成曲细精管;20 w胎牛生殖细胞增殖较快;出生时,曲细精管完全形成,曲细精管中只有支持细胞和雄性生殖干细胞,并且间质组织少,有利于生殖细胞的分离。采用不同解离方法,对53例新生牛睾丸处理结果显示,以0.1%的胶原酶+5 ng/mL DNaseⅠ消化30 min和0.25%胰酶+0.04% EDTA+5 ng/mL DNaseⅠ消化5 min,分段处理能有效离解睾丸组织,获取单细胞或细胞团。对5例上述离解的睾丸细胞的mGSCs进行纯化,结果显示,3次贴壁差法比percoll密度梯度离心获得的mGSCs细胞活力强;mGSCs活性和纯度分别达到76.7%和98.2%;3次贴壁差法纯化的新生牛mGSCs根据大小可分为2类,一类细胞直径超过25μm,数量较少,占总细胞数量的15%左右,细胞质的流动性是其显著特点;另一类细胞直径小于15μm,数量较大,占总细胞数量的85%左右。两类细胞中CD117（c-kit）阳性细胞为18.91%。分离新生牛的生殖细胞中,透射电镜可观察到典型AsAal以及A1A4型精原细胞,其主要区分为核仁形态、常染色质和异染色质的分布不同,未见胞质桥结构,所有观察的细胞均显示细胞质结构简单,含有包囊体,局部区域分布有简单的线粒体和核糖体。表明新生牛睾丸中已有多类型的精原细胞;支持细胞与生殖细胞之间存在桥粒和空隙连接。在DMEM+10%NBS基础培养液中,支持细胞在传至12代,细胞形态从类似铺路石样细胞转变成短梭状细胞。mGSCs-BSCs共培养系统中,BSCs可以促进前3代mGSCs

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 哺乳动物雄性生殖干细胞的来源
• 1.1 哺乳动物生殖细胞分化图谱
• 1.2 PGCs 的基本特性及其雄性化机理
• 1.3 哺乳动物雄性化机理
• 1.3.1 哺乳动物雄性化器官发生机理（图1-3）
• 1.3.2 哺乳动物PGCs 雄性化机理
• 第二章 哺乳动物雄性生殖干细胞的生物学特征
• 2.1 mGSC 的生物学特性
• 2.1.1 mGSCs 数量
• 2.1.2 精原干细胞的自我更新和分化特性
• 2.1.3 mGSCs 微环境
• 2.1.4 mGSC 不确定的细胞周期
• 2.1.5 mGSCs 的迁移能力
• 2.2 雄性生殖干细胞体内富集
• 2.3 mGSC 形态学和分子标志及免疫学特性
• 2.3.1 mGSC 的形态学
• 2.3.2 mGSC 的分子标志
• 第三章 哺乳动物雄性生殖干细胞的分离纯化
• 3.1 哺乳动物睾丸的形态结构特性
• 3.2 雄性生殖干细胞的制备
• 3.2.1 睾丸组织细胞的解离
• 3.2.2 mGSCs 的分离纯化
• 第四章 哺乳动物雄性生殖干细胞体外培养的影响因素
• 4.1 培养基及血清
• 4.1.1 基础培养液的确定
• 4.1.2 血清
• 4.2 其他细胞的作用
• 4.2.1 饲养层细胞的利用
• 4.2.2 支持细胞（sertoli cells, SCs） 的作用
• 4.3 细胞因子
• 4.3.1 干细胞因子（stem cell factor, SCF）
• 4.3.2 白血病抑制因子（LIF）
• 4.3.3 胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor ，GDNF）
• 4.3.4 表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）
• 4.4 添加剂、激素和维生素的应用
• 4.4.1 添加剂
• 4.4.2 激素及维生素
• 4.5 培养温度的确定
• 第五章 哺乳动物生殖细胞减数分裂及移植研究进展
• 5.1 雄性生殖细胞体外减数分裂研究进展
• 5.1.1 体外睾丸细胞株的建立
• 5.1.2 曲细精管培养法
• 5.1.3 胚胎干细胞减数分裂研究
• 5.1.4 精原干细胞的减数分裂研究
• 5.2 体内移植m GSCs 诱导精子发生过程恢复研究进展
• 5.2.1 mGSC 同种间移植
• 5.2.2 mGSC 异种间移植
• 5.2.3 mGSCs 移植的方法
• 试验研究
• 前言
• 第六章 牛生殖细胞的生长发育及新生牛MGSC 的分离纯化
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 不同发育阶段牛睾丸组织结构比较
• 6.2.2 不同消化方式处理新生牛睾丸曲细精管细胞分散程度
• 6.2.3 新生牛mGSCs 贴壁速率差法分离纯化效果
• 6.2.4 新生牛mGSCs Percoll 法分离纯化效果
• 6.2.5 新生牛mGSCs 形态特征
• 6.3 讨论
• 6.3.1 睾丸组织的细胞类型和酶消化法的最佳方案
• 6.3.2 纯化新生牛mGSCs 不同方法
• 6.3.3 分离纯化的新生牛mGSCs 形态特征
• 6.4 小结
• 第七章 新生牛MGSCS 的体外培养行为
• 7.1 材料方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 MEF 和BSCs 饲养层细胞增殖和存活规律
• 7.2.2 mGSCs 生长规律
• 7.3 讨论
• 7.3.1 支持细胞（SCs）体外培养
• 7.3.2 培养系统对新生牛mGSCs 生长增殖分化的影响
• 7.3.3 无饲养层系统中mGSCs 的生长行为
• 7.3.4 新生牛mGSCs 两类集落的形成及特性
• 7.4 小结
• 第八章 体外诱导新生牛MGSCS 向单倍体细胞分化
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 方法
• 8.2 结果
• 8.2.1 不同RA 浓度诱导新生牛mGSCs 形成精子样细胞的效率
• 8.2.2 RA 诱导新生牛mGSCs 形成精子样细胞
• 8.2.3 RA 和OA 联合诱导新生牛mGSCs 的效果
• 8.2.4 诱导产生的精子样细胞的形态
• 8.2.5 流式细胞仪分拣精子样细胞
• 8.2.6 牛卵母细胞ICSI 试验
• 8.3 讨论
• 8.3.1 生殖细胞体外减数分裂的实现
• 8.3.2 体外诱导形成精子样细胞的检测
• 8.4 小结
• 第九章 无内源性生殖细胞模型兔制作与新生牛MGSCS 的移植
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 方法
• 9.2 结果
• 9.2.1 无内源性生殖细胞模型兔构建
• 9.2.2 新生牛mGSCs 向模型兔睾丸体内移植及观察
• 9.3 讨论
• 9.3.1 皮下注射白消安对受体兔的影响
• 9.3.2 mGSCs 异体移植后的免疫排斥分析
• 9.3.3 mGSCs 移植方法与效果
• 9.4 小结
• 结论
• 本研究的创新点
• 进一步研究的内容
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介