白芷提取物对葛根、黄芩、川芎中活性成分生物药剂学性质—膜透过性的影响及机理研究

论文摘要

药物透过肠道的膜通透性质是影响药物口服后经胃肠道吸收的主要因素,中药配伍后可能改变药物活性成分的膜通透性。本文旨在研究葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸的肠道转运特性、白芷提取物对其转运制性的影响以及影响机理。阐明各成分本身的小肠吸收机理；明确白芷提取物对三种成分肠吸收的作用特点,总结其作用规律；从分子生物角度阐明白芷提取物改变三种成分肠通透性的作用机理。考察白芷提取物的细胞毒性及肠黏膜毒性,评价其用作肠道转运吸收促进剂的可行性,为开发新型辅料一吸收促进剂奠定基础。目的：1.研究白芷提取物对葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的影响,从生物药剂学的角度阐明白芷与它药配伍使用的原理。2.研究葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸小肠吸收机制,结合白芷提取物对其肠吸收的影响,探讨白芷对配伍药物中活性成分肠道转运的影响规律。3.研究白芷提取物对细胞间紧密连接蛋白、外排蛋白（P-gp）、细胞膜流动性等肠道转运屏障的影响,从细胞、蛋白分子等水平上探讨白芷提取物对肠吸收转运阻力的易化作用,从分子机理水平阐明白芷改变配伍药物活性成分膜通透性的作用机理。4.研究白芷提取物的毒性,探索白芷活性成分用作肠道转运吸收促进剂的可行性,为开发新型辅料一吸收促进剂奠定基础。方法：1.检索近年来国内外有关“白芷”、“配伍规律”、“葛根”、“黄芩”、“川芎”、“生物药剂学”、“肠道转运”等文献,分析综述中药复方配伍规律、中药配伍对药物肠道转运等生物药剂学性质的影响。2.建立白芷提取物中欧前胡索、异欧前胡索、总香豆素等含量测定方法；采用大孔树脂分离纯化技术制备白芷提取物;采用水蒸气蒸馏法制备白芷挥发油。3.外翻肠囊法、Caco-2细胞模型及大鼠在体单向灌流法研究白芷提取物对葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的变化；分别计算配伍前后葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸表观渗透系数（Papp）,分析白芷两个活性组份对各相配药物中有效成分肠吸收的协同效应。4.采用Caco-2细胞模型及大鼠在体单向潍流法分别研究稿根中葛根、黄芩中黄岑苷、川芎阿魏酸的肠吸收机制：并分别以肠微粒体、细胞问紧密连接涧节剂（EDTA）.外排蛋白抑制剂为工具,探讨各种肠吸收屏障分别在捣根索、黄芩苷、阿魏酸肠道转运过程中的参与度。5.运用Caco-2细胞模型,采用高效液相、荧光探针标记、蛋白印迹（Western Blot）、流式细胞等技术和手段,分别研究白芷提取物对Caco-2细胞紧密连接蛋白（ZO-1）、细胞坩架蛋白（Actin）、P-gp外排蛋白功能及表达的影响,以及对Caco-2细胞膜流动性的影响。分析白芷活性成分影响葛根中葛根素、黄芩中黄芩讣、川芎中阿魏酸生物药剂学性质的机理。6.通过病理切片、MTT浊以及Caco-2细胞电阴可逆性测定,研究白芷活性纽分对细胞形态学、组织化学等的影响,探讨白芷活性组分的毒性及其可逆性。结果1.通过三种办法左证,得出白芷活性成分能显著健进葛根中葛根素、黄岑中黄岑苷的肠吸收作用（p<0.05）,而葛根素和黄芩苷均为难吸收药物,白以活性成分可能对配伍对药中难吸收成分具有吸收作用。全白芷活性成分穿川芎中阿魏酸的肠吸收影响不明显。2.分别研究了葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠吸收特性,明确了葛根中葛根索、黄芩中黄芩苷及川芎中阿魏酸三个有效成分肠吸收机理。得出（1）葛根中葛根素的吸收机制以被动转运为主,同时存在着主动转运,P-gp和MRP蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。（2）黄芩中黄芩苷的吸收机制以被动转运为主,同时存在着主动转运,其转运可能不受P-gp蛋白的影响,MRP蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。（3）川芎中阿魏酸的转运过程存在主动载体转运,国入紧密连拨调节剂EDTA后,川芎中阿魏酸肠道转运稍有增加,但作用不显著，印证了其肠道转运以主动转运为主,P-gp和MRP蛋白可能为其主要载体并参与转运的过程,有关期及收机理有待进一步的研究。分别研究了葛根中葛根索、黄苷中黄芩苷、川芎中阿魏魏酸在肠微粒体中代谢情况,分别筛选了肠微粒体系中葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸浓度：进一步研究了白芷配伍各约后,葛根素、黄芩苷、阿魏酸在肠微粒体中代谢情况,得出了白芷各活性成分对肠微粒体中各代谢酶无影响的结论。3.采用Caco-2细胞模型,采用蛋白印迹技术开展了白芷活性成分对细胞间紧密连接蛋白ZO-l及骨架蛋白Actin的影响研究；采用流式细胞技术研究了白芷活性成分以P-gp蛋白表达的影响；采用荧光探针标记法研究了白芷活性成分对细胞膜流动性的影响。结果发现白芷活性成分可以抑制细胞间紧密连接蛋白ZO-1和肌动蛋白Aactin的表达；白芷活性成分可以抑制P-gp外排蛋白的功能及蛋白表达：而白芷活性成分对细胞膜流动性影响较小,结果差异无统计学意义（p>0.05）,白芷活性成分促进配伍药物中活性成分的肠道转运的机制可能与细胞膜流动性无关。4.采用LDH、MTT法、电阻可逆性测定、肠黏膜病理切片,综合评价白芷活性成分的毒性及其可逆性。分析判断白芷活性成分作为肠道转运吸收促进剂的可行性。得出白芷活性成分在用量范围内对细胞或肠黏膜组织无毒性的结论。根据此结论,我们认为白芷活性组分具有外发为新型辅料——吸收促进剂的潜能。结论采用不同肠吸收模型研究了白芷对配伍药物有效成分吸收的影响,得出了白芷对部分配伍药物中有效成分具有一定的吸收促进作用,初步了解了白芷对配伍药物中活性成分生物药剂学性质的影响规律,有助于我们从生物药剂学角度阐明白芷药物配伍的原理。明确了各配伍药物中有效成分的肠吸收机制以及白芷提取物对各肠吸收屏障的作用机制,结合白芷活性成分的毒性评价,从更深的层面上阐明了白芷-葛根、白芷-黄芩、川芎-川芎药物配伍原理。本课题可为中药配伍理论研究提供新思路；为在中医药理论指导下寻找吸收促进剂提供新思路。本课题的研究结果也将为白芷活性成分开发成新型辅料—吸收促进剂奠定基础;为白芷配伍组方,提高原方疗效提供理论依据。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 第一章 提取物的制备研究
• 第一节 白芷提取物及白芷挥发油的制备
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 实验方法
• 2.1 工艺流程图
• 2.2 指标成分含量方法的建立
• 2.3 白芷香豆素的制备
• 2.4 白芷挥发油的制备
• 3 实验结果
• 3.1 指标性成分分析方法
• 3.2 白芷香豆素的制备
• 3.3 白芷挥发油的制备
• 第二节 葛根、黄芩、川芎提取物的制拼
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 实验方法
• 2.1 提取工艺路线图
• 2.2 黄芩提取物制备及黄芩提取物中黄芩苷含量测定
• 2.3 葛根提取物制备及葛根提取物中葛根素含量测定
• 2.4 川芎提取物制备及川芎提取物中阿魏酸含量测定
• 3 实验结果
• 3.1 黄芩提取物制备及黄芩提取物中黄芩苷含量
• 3.2 葛根提取物制备及葛根提取物中葛根素含量
• 3.3 川芎提取物制备及川芎提取物中阿魏酸含量
• 本章研究小结
• 第二章 白芷对葛根、黄芩、川芎中活性成分生物药剂学性质的影响
• 第一节 样品分析方法的建立
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 实验方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 黄芩中活性成分黄芩苷生物样品分析方法的建立
• 2.3 葛根活性成分葛根素生物样品分析方法的建立
• 2.4 川芎活性成分阿魏酸生物样品分析方法的建立
• 3 实验结果
• 3.1 黄芩中活性成分黄芩苷生物样品分析方法
• 3.2 葛根中活性成分葛根素生物样品分析方法
• 3.3 川芎中活性成分阿魏酸生物样品分析方法
• 4 讨论
• 第二节 外翻肠囊模型研究白芷对黄岑、葛根、川芎中活性成分肠吸收的影响
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 色谱条件
• 2.3 大鼠外翻肠囊模型
• 2.4 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 白芷提取物对黄芩苷在不同肠段吸收的影响
• 3.2 白芷提取物对葛根素在不同肠段吸收的影响
• 3.3 白芷提取物对阿魏酸在不同肠段吸收的影响
• 4 讨论
• 第三节 在体单向肠灌流研究白芷对黄芩、葛根、川芎活性成分肠吸收的影响
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 溶液的配制
• 2.2 色谱条件
• 2.3 大鼠在体单向肠灌流模型
• 2.4 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 白芷提取物对黄芩苷在十二指肠吸收的影响及黄芩苷吸收特性研究
• 3.2 白芷提取物对葛黄根素在空肠吸收的影响及葛根素肠吸收特性研究
• 3.3 白芷提取物对阿魏酸在十二指肠吸收的影响
• 4 讨论
• 第四节 Caco-2细胞模型的建立
• 1 仪器与材料
• 1.1 细胞来源
• 1.2 仪器
• 1.3 试药
• 2 实验方法
• 2.1 Caco-2细胞模型的建立
• 2.2 Caco-2细胞单层模型的验证
• 3 实验结果
• 3.1 光学显微镜观察
• 3.2 碱性磷酸酶的活性
• 3.3 跨膜电阻
• 3.4 标志物的渗漏检查
• 4 讨论
• 第五节 Caco-2细胞模型研究白芷对黄芩、葛根、川芎中活性成分肠吸收的影响
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 细胞及细胞培养用试剂
• 1.3 试药
• 2 实验方法
• 2.1 药物配制
• 2.2 色谱条件
• 2.3 Caco-2细胞模型的药物转运实验研究
• 2.4 样品处理
• 2.5 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 白芷提取物对葛根素在Caco-2细胞单层转运的影响
• 3.2 白芷提取物对黄芩苷在Caco-2细胞单层转运的影响
• 3.3 白芷提取物对阿魏酸在Caco-2细胞单层转运的影响
• 4 讨论
• 本章研究小结
• 第三章 葛根、黄芩、川芎中活性成分吸收机理研究
• 第一节 在体单向肠灌流模型研究黄芩、葛根、川芎中活性成分转运特性
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 K-R液的配制
• 2.2. 色谱条件
• 2.3 大鼠在体单向肠灌流模型的建立
• 3 实验结果
• 3.1 黄芩中黄芩苷肠吸收机制研究
• 3.2 葛根中葛根素肠吸收机制研究
• 3.3 川芎中阿魏酸肠吸收机制研究
• 4 讨论
• 第二节 Caco-2细胞模型研究黄芩、葛根、川芎中活性成分转运特性
• 1 仪器与材料
• 1.1 细胞来源
• 1.2 仪器
• 1.3 试药
• 2 实验方法
• 2.1 色谱条件
• 2.2 药物配制
• 2.3 Caco-2细胞培养条件
• 2.4 Caco-2细胞模型的药物转运实验研究
• 2.5 样品处理
• 2.6 数据分析
• 3 实验结果
• 3.1 葛根提取物中葛根素在Caco-2细胞单层模型的吸收机制研究
• 3.2 黄岑中黄芩苷在Caco-2细胞单层模型的吸收机制研究
• 3.3 川芎中阿魏酸在Caco-2细胞单层模型的吸收机制研究
• 4 讨论
• 第三节 配伍“对药”活性成分在肠微粒体中的代谢研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 实验方法
• 2.1 色谱条件
• 2.2 葛根素、黄芩苷、阿魏酸在磷酸缓冲盐溶液中的稳定性考察
• 2.3 葛根素、黄芩苷、阿魏酸在磷酸氢二钾溶溶液中的稳定性考察
• 2.4 肠微粒体孵育体系
• 2.5 样品处理
• 3 实验结果
• 3.1 葛根素、黄芩苷、阿魏酸在磷酸缓冲液中的的稳定性
• 3.2 黄芩苷、阿魏酸在磷酸氢二钾溶液中的稳定性
• 3.3 葛根中葛根素、黄芩苷中黄芩苷、川芎阿魏酸肠微粒体中的代谢
• 4 讨论
• 本章研究小结
• 第四章 白芷改变配伍药物中活性成分生物药剂学性质的分子机理研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 细胞来源
• 1.2 仪器
• 1.3 试药
• 2 实验方法
• 2.1 Caco-2细胞培养
• 2.2 白芷活性组分对细胞膜流动性的影响
• 2.3 白芷活性组分对细胞内R-123蓄积量的影响
• 2.4 Actin蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting分析
• 2.5 ZO-1蛋白的SDS-PAGE和Western-blotting分析
• 2.6 流式细胞术研究白芷活性组份对P-gp蛋白表达的影响
• 2.7 白芷对配伍“对药”活性成分在肠微粒体中代谢的影响研究
• 3 实验结果
• 3.1 白芷活性组分对细胞膜流动性的影响
• 3.2 白芷活性组分对R-123的Caco-2细胞蓄积的影响
• 3.3 蛋白测定标准曲线
• 3.4 白芷活性组分对Caco-2细胞骨架肌动蛋白（Actin）的影响
• 3.5 白芷活性组分对Caco-2细胞紧密连接蛋白（ZO-1）的影响
• 3.6 白芷活性组分对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响
• 3.7 白芷活性组分对配伍“对药”活性成分在肠微粒体中代谢的影响
• 4 讨论
• 本章研究小结
• 第五章 白芷提取物用作吸收促进剂的毒性评价研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 实验方法
• 2.1 试剂及药液配制
• 2.2 白芷活性成分对外翻肠囊黏膜形态观察
• 2.3 MTT法研究白芷活性成份对Caco-2细胞单层的毒性影响
• 2.4 电阻可逆性研究白芷活性成分对Caco-2细胞单层的毒性影响
• 3 实验结果
• 3.1 白芷活性成分对外翻肠囊黏膜形态观察
• 3.2 MTT法研究白芷配伍对药对Caco-2细胞单层的毒性影响
• 3.3 电阻可逆性研究白芷活性成分对Caco-2细胞单层的毒性影响
• 4 讨论
• 论文结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附件一：综述
• 附件二：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果