江西省野生寒兰的ISSR遗传多样性研究

论文摘要

本研究采用ISSR分子标记主要对江西省寒兰（Cymbidium kanran Makino）的遗传多样性进行了分析,目的在于了解寒兰居群的遗传多样性水平、遗传结构以及居群间的遗传分化,为寒兰资源的保护与开发利用提供理论依据。按开花季节来分,寒兰主要分为春季开花寒兰类型、夏季开花寒兰类型和秋季开花寒兰类型三种。按叶片大小来分,可分为大叶寒兰类型和小叶寒兰类型两种。因此,我们也分别进行了不同类型之间寒兰的遗传差异分析。主要结果如下：建立了适合于寒兰的ISSR-PCR反应体系和反应程序。25μl PCR反应体积中,1*PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,100 ng模板DNA,200¨μmol/L dNTP, 1.4 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物。最佳扩增程序为：94℃预变性5 min,然后进行40个循环：94℃变性45 s,复性温度根据各引物筛选的温度而定,45s,72℃延伸80 s,循环结束后72℃延伸7 min。。筛选出12条ISSR引物对江西省各地的119个寒兰个体及福建省武夷山市和邵武市75个个体,总共194个寒兰个体进行了扩增,共得到123条谱带,其中多样性条带为97条（多态性条带百分率为78.9%）。所有秋季开花寒兰类型居群（包括大、小叶）,在遗传多样性方面,寒兰在总的水平上的遗传多样性较高（PPF=79.67％,Na=1.7967,Ne=1.4461,Hpop=0.2669,I=0.3995）；在居群水平上遗传多样性水平相对较低（PPF=43.97%,Na=1.4397,Ne=1.2478,Hpop=0.1462,I=0.2204）。其中福建武夷山市小叶寒兰居群的遗传多样性最高（PPF=52.85％, Hpop=0.1732,I=0.2622）。在遗传结构方面,各居群间存在较高的遗传分化水平,遗传分化系数（GST）为0.4719,这表明居群内的遗传分化大于居群间的遗传分化。UPGMA聚类分析及主成分分析结果也显示秋季开花类型寒兰可分化为四个支系,支系Ⅰ为宜丰（YH）、井冈山（JGS）和靖安（AH）3个居群；支系Ⅱ为资溪（ZX）、武夷山市大叶和武夷山市小叶（WY和WYXH）的3个居群；支系Ⅲ为邵武市的大叶和小叶2个居群（SW和SWXH）;支系Ⅳ为石城（SC）、安远（GZ-A）、以及崇义大叶和小叶（GZ-C、GZXH）4个居群。其中支系Ⅰ和Ⅱ聚在一起,Ⅲ和Ⅳ聚在一起。这也说明不同山脉的遗传多样性结构不同,且Mental检验结果表明遗传距离和地理距离之间没有显著相关性（r=0.3791）。对于不同开花季节寒兰类型来说,居群间的遗传分化系数（GST）为0.5231,说明居群间的遗传分化大于居群内的遗传分化。UPGMA聚类分析及主成分分析结果显示不同开花季节寒兰类型居群的遗传多样性存在明显差异。对于大叶寒兰和小叶寒兰两个类型来说,居群间的遗传分化系数（GST）为0.0363,基因流水平（Nm）为13.2655,大于1,说明这两个类型间的基因交流频繁。通过对大、小叶寒兰两个类型居群的遗传差异分析得出二者之间的遗传变异为7.64%。UPGMA聚类分析及主成分分析结果也显示大、小叶寒兰居群间遗传差异不大。因此,我们可以认为从进化水平上应同属一个种,只是叶片形态有所差异。对于武夷山脉段寒兰居群来说,居群间的遗传分化系数（GST）为0.3781,说明居群内的遗传分化大于居群间的遗传分化。UPGMA聚类分析及主成分分析结果显示同一山脉段的居群结构差异不大,且Mental检验结果表明遗传距离与地理距离的相关性不显著（r=0.5854）。此外,根据寒兰遗传多样性分布格局,提出了相应的保护策略,如就地保护,人工引种等。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 遗传多样性概念及研究意义
• 1.2 ISSR分子标记技术及其应用
• 1.3 中国寒兰研究进展
• 1.3.1 寒兰的生物学特性
• 1.3.2 我国寒兰研究现状
• 1.4 本研究的目的、研究内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 实验试剂及其来源
• 2.2.2 主要仪器及其来源
• 2.2.3 主要溶液
• 2.3 微量液氮法提取基因组DNA
• 2.4 DNA样品的检测
• 2.5 ISSR—PCR扩增
• 2.5.1 ISSR反应体系条件及引物筛选
• 2.5.2 ISSR反应程序
• 2.5.3 电泳和拍照
• 2.6 数据分析
• 2.6.1 谱带统计与数据矩阵的建立
• 2.6.2 POPGENE软件分析遗传多样性水平及其参数指标
• 2.6.3 利用WINAMOVA软件分析遗传分化
• 2.6.4 利用NTSYSpc软件进行聚类分析
• 2.6.5 主成分分析
• 2.6.6 遗传距离与地理距离的相关性检验
• 第三章 结果
• 3.1 DNA提取
• 3.2 ISSR-PCR反应条件的优化
• 2+浓度'>3.2.1 Mg²⁺浓度
• 3.2.2 TaqDNA聚合酶辅助因子浓度
• 3.2.3 dNTP浓度
• 3.2.4 DNA模板浓度
• 3.2.5 循环次数及循环中延伸时间
• 3.2.6 退火温度梯度
• 3.3 引物筛选及ISSR扩增结果
• 3.4 ISSR结果的统计分析
• 3.4.1 寒兰的遗传多样性分析
• 3.4.2 寒兰的遗传结构分析
• 3.4.3 遗传距离和聚类分析
• 3.4.4 主成分分析（PCA）
• 3.4.5 遗传距离和地理距离的相关性分析
• 第四章 讨论
• 4.1 基因组DNA提取
• 4.2 ISSR扩增条件的优化
• 4.3 寒兰的遗传多样性
• 4.4 寒兰的遗传结构
• 4.5 不同寒兰居群的遗传差异比较
• 4.5.1 江西省大叶寒兰居群的遗传差异
• 4.5.2 不同季节开花寒兰居群的遗传差异
• 4.5.3 大、小叶寒兰居群的遗传差异
• 4.5.4 武夷山脉段寒兰居群的遗传差异
• 4.6 保护策略建议
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果