云芝与赤芝原生质体融合的研究

论文摘要

随着人们健康意识的提高和科学的发展,蕈菌作为一类既美味可口又具有医疗保健功能的食品受到了人们的广泛欢迎。云芝和赤芝都是我国传统的名贵中药真菌,其营养物质全面且药用价值高,具有抗癌、降血糖、有效提高免疫力等功效,因此价格十分昂贵。原生质体融合技术已成为蕈菌遗传育种中的重要手段之一。它扩大了物种之间的杂交范围,使得远缘杂交成为可能,扩大了蕈菌的记忆库容。试验采用原生质体融合技术,将云芝与赤芝的原生质体融合,并进行融合子的筛选和鉴定,以期获得兼具云芝和赤芝优点的融合子。试验研究了影响云芝和赤芝原生质体制备与再生几个主要因素,运用正交试验,确定以培养5d的云芝菌丝体,用2%的溶壁酶,以0.6mol/L的MgSO4为渗稳剂,33℃下酶解3h作为云芝原生质体的制备条件;以培养7d处于的赤芝菌丝体,用1.5%的溶壁酶,以0.6mol/L的MgSO4为渗稳剂,30℃下酶解2h作为赤芝原生质体的制备条件,获得数量最多、活性最高的原生质体,并且确定采用麦芽糖10g、葡萄糖4g、酵母粉4g、琼脂5.5g,以0.6M蔗糖作渗稳剂的再生培养基其再生效果最好。利用云芝和赤芝对潮霉素天然抗药性的差异,结合原生质体灭活作为融合子筛选的依据,并在PEG诱导下使两蕈菌原生质体融合下,得到了6株生长良好的融合株,融合率较低仅为1.76×10-5。通过对随机抽取的融合株F5与两亲本进行菌丝生长速度,液体生物量积累,菌丝显微特征,菌落表型,DNA含量的比较以及三者的拮抗试验,我们可以初步确定该融合株确为云芝与赤芝原生质体融合的产物,且融合子F5更接近云芝。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 原生质体及其融合技术的发展概况
• 1.1 动物原生质体融合的进展
• 1.2 植物原生质体融合的进展
• 1.3 微生物原生质体融合的进展
• 1.4 大型真菌原生质体融合的进展
• 2 原生质体融合技术一般路线及方法
• 2.1 亲本标记（融合子的检出）
• 2.2 原生质体的制备与再生
• 2.3 原生质体融合方法
• 2.4 原生质体的再生
• 2.5 融合子的验证
• 3 研究目的和意义
• 4 云芝与赤芝原生质体融合的主要技术路线
• 第二章 培养基的筛选及确定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试验试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 培养基
• 1.5 培养方法
• 2 结果与分析
• 2.1 云芝对氮素营养的利用
• 2.2 云芝对碳素营养的利用
• 2.3 正交试验结果与分析
• 1使用量筛选结果与分析'>2.4 无机盐及微生素VB₁使用量筛选结果与分析
• 2.5 生长曲线的测定结果
• 3 小结
• 第三章 云芝和赤芝原生质体制备与再生
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌丝体的培养方式
• 2.2 原生质体的释放方式及其对再生的影响
• 2.3 原生质体制备与再生的单因素实验结果
• 2.4 正交试验结果
• 2.5 不同培养基对原生质体再生的影响
• 3 讨论
• 3.1 渗稳剂对原生质体制备与再生的影响
• 3.2 菌龄对原生质体制备与再生的影响
• 3.3 酶系统对于原生质体制备与再生的影响
• 3.4 酶解温度对原生质体制备与再生的影响
• 3.5 酶解时间对原生质体形成率的影响
• 4 小结
• 第四章 抗性标记的选择
• 1 云芝和赤芝对潮霉素的天然抗药性
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与讨论
• 2 原生质体在潮霉素培养基上的再生
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 3 小结
• 第五章 原生质体的融合及融合子的检出
• 1 材料与方法
• 1.1 亲本原生质体
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 培养基组成
• 1.5 渗透压稳定剂
• 1.6 原生质体灭活
• 1.7 原生质体融合
• 1.8 融合子的检出
• 2 结果与讨论
• 2.1 热灭活试验结果
• 2.2 紫外灭活试验结果
• 2.3 融合试验结果
• 2.4 融合子的检出结果
• 第六章 融合株的检验
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 培养基组成
• 2 结果
• 2.1 亲本与融合株生长速率比较
• 2.2 亲本与融合株生物量积累的测定
• 2.3 亲本与融合株菌落特征比较
• 2.4 亲本与融合株菌丝体特征比较
• 2.5 亲本与融合株DNA含量的测定
• 2.6 亲本与融合株的拮抗试验
• 3 小结
• 第七章 试验总结
• 1 原生质体制备与再生
• 2 亲本菌株的标记
• 3 原生质体融合的影响因素
• 4 融合子的检出及检验
• 5 试验的创新之处
• 6 试验有待改进的部分
• 参考文献
• 致谢