三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立

论文摘要

三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料,但是却被不法商贩添加到食品、饲料、乳制品中,作为“假蛋白”来提高产品或制品的蛋白含量。目前研究表明,三聚氰胺长期摄入则会造成生殖、泌尿系统的损伤、膀胱和肾脏结石,甚至可进一步诱发膀胱癌。因此应建立一种快速、简便、准确、灵敏的检测技术,以避免三聚氰胺通过食物链而危害人类的健康。首先,以BSA和OVA为载体,采用重氮法合成免疫抗原三聚氰胺-BSA和检测抗原三聚氰胺-OVA,使用聚丙烯凝胶电泳对合成抗原进行分析,用BCA法测定合成抗原含量分别为三聚氰胺-BSA平均蛋白浓度1917.10μg.mL-1和三聚氰胺-OVA平均蛋白浓度3546.68μg.mL-1,使用紫外分光光度计测定三聚氰胺和载体蛋白的偶联比率分别为三聚氰胺-BSA17.8和三聚氰胺-OVA26。其次,利用合成的三聚氰胺-BSA以腹腔注射途径免疫6周龄健壮活泼雌性Balb/c小鼠,以5μg.mL-1三聚氰胺-OVA包被酶标板,利用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价。经五次免疫,每次间隔21d,选择血清效价最高的小鼠进行细胞融合（≥1：16000）,将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3350作用下进行融合,利用已建立的间接ELISA方法筛选出阳性克隆,采用有限稀释法进行克隆,得到一株能够稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的细胞株3G4,其染色体数目在93条左右,抗体亚类鉴定试剂盒鉴定该单抗的重链为IgG2b,轻链为κ,轻链分子质量约32KD,重链分子质量约54KD,分子质量约为172KD,纯化后纯度可达80%以上；经连续传代40次,反复冻存、复苏,仍能稳定分泌抗三聚氰胺抗体,用间接ELISA方法检测细胞上清液效价均在1：1600以上,生长状态良好,且无污染情况；用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化的腹水抗体纯化前效价为1：5×105（P/N>2.337）,纯化后效价为1：105（P/N>3.098）,亲和力常数为2.28×107L.mL-1,且与载体蛋白无交叉反应性。最后,利用抗三聚氰胺单抗建立了间接竞争ELISA方法,并对其进行条件优化。采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg.mL-1,最佳包被时间为4℃包被过夜,最佳封闭条件为4%脱脂乳37℃封闭2h,最佳抗体工作浓度为1：1000,最佳竞争方式为板内竞争,最佳竞争时间为37℃孵育2h,最佳酶标二抗稀释度为1：70000,最佳二抗作用条件为37℃孵育45min,最佳底物作用时间为15min。根据以上条件绘制标准曲线,校正曲线范围为0.1ng～1mg,线性方程为y=-15.12x+107.3（R2=0.997）,计算出三聚氰胺最低检出限为2ng.mL-1（OD最低检出限=90.33%）,IC50为0.527μg.mL-1,敏感度为6.236～20.985μg.mL-1。根据交叉反应率的抑制率,计算出三聚氰胺与三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的交叉反应率分别为29.88%、13.36%、0%。批内CV平均值为3.05%,批间CV平均值为7.4%,确定此方法精确度良好。利用已建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准液的样品（宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋）,计算三聚氰胺在各样品中的回收率,得到回收率范围分别为宠物食品73.8%-84.32%,平均达到79.06%；小麦面筋67.3%-88.27%,平均达到77.79%；饲料70.3%-85.9%,平均达到78.1%；牛乳83.47%-89.76%,平均达到86.62%；鸡蛋76.2%-87.29%,平均达到81.75%,确定此间接竞争ELISA方法能够较准确的测定样品中的三聚氰胺含量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 三聚氰胺的理化特性
• 1.2 三聚氰胺的代谢动力学特点
• 1.3 三聚氰胺的中毒机制及毒害作用
• 1.4 三聚氰胺的主要检测方法
• 1.5 小分子抗原合成基本原理
• 1.6 单克隆抗体技术
• 1.7 三聚氰胺相关研究近况与发展
• 1.8 本课题的研究目的与意义
• 第二章 三聚氰胺完全抗原的合成及鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.3 结果
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 三聚氰胺单克隆抗体的制备及初步鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 小结与分析
• 第四章 三聚氰胺检测间接竞争ELISA方法的建立及优化
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果
• 4.4 小结与分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢