人参愈伤组织细胞表达HBsAg-rhIFNα-2b融合蛋白的研究

论文摘要

乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因已相继在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫杆状病毒体系中表达。其中产业化的有酵母和CHO系统两种。由于这两种系统表达的HBsAg制备的疫苗仍然有5-10%的人群不产生抗体,因此,人们一直在探索能够更有效刺激机体产生HBsAg抗体的新型疫苗。重组人干扰素α-2b（rhIFNα-2b）是治疗乙肝最有效的药物,在人参细胞中表达其与HBsAg的融和蛋白做为抗原,借助人参皂甙的免疫增强作用,有可能使机体产生更强的细胞免疫和体液免疫,并获得治疗性乙肝疫苗。本研究构建了携带HBsAg-rhIFNα-2b融合基因的植物细胞表达载体,采用农杆菌感染方法将其整合到人参愈伤组织细胞的染色体上,得到了能够表达HBsAg-IFNα-2b融合蛋白的人参愈伤组织细胞系（150）。在试验中还建立了固体和液体培养两种培养系统。该细胞系不仅可以表达HBsAg-IFNα-2b融合蛋白,而且可以产生具有增强疫苗免疫效果作用的人参皂甙。本研究获得的基因工程乙肝疫苗无需纯化,也不用额外添加疫苗佐剂,直接免疫小鼠和家兔就能够产生有效的免疫应答。转基因植物组织细胞作为生物反应器具有广阔的应用前景。本研究为利用植物组织培养技术表达和生产医用重组蛋白提供了技术平台,为其它珍稀药用植物的开发利用、组织培养及表达重组蛋白奠定了坚实基础。

论文目录

• 提要
• 前言
• 第一篇 文献回顾
• 第1章 乙肝病毒的基因结构和致病机理
• 第2章 乙肝疫苗的研究与应用
• 第3章 干扰素的研究与应用
• 第4章 人参愈伤组织的细胞培养
• 第5章 植物基因工程医药研究进展
• 第二篇 实验研究
• 第1章 HBsAg—rhINFα-2b 融合蛋白植物表达载体的构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 HBsAg 基因的获得
• 1.2.2 rhIFNα-2b 基因的获得
• 1.2.3 克隆载体的构建
• 1.2.4 表达载体的构建
• 1.3 结果
• 1.3.1 PCR 扩增HBsAg 基因电泳结果
• 1.3.2 PCR 扩增rhIFNα-2b 基因电泳结果
• 1.3.3 克隆载体的鉴定
• 1.3.4 表达载体的鉴定
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 HBsAg-rhIFNα-2b 转基因人参愈伤组织细胞系的建立
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞系抗生素敏感实验
• 2.2.2 农杆菌感染人参愈伤组织细胞
• 2.2.3 转基因细胞的筛选、鉴定
• 2.2.4 转基因人参愈伤组织悬浮培养细胞系的建立
• 2.3 结果
• 2.3.1 细胞抗生素敏感实验
• 2.3.2 转基因细胞的筛选、鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 150 细胞中HBsAg- rhIFNα-2b 的表达、粗提及性质研究
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 ELISA 法检测HBsAg 蛋白表达
• 3.2.2 鼠抗HBsAg 免疫血清制备
• 3.2.3 Western blotting 法检测HBsAg 蛋白表达
• 3.2.4 免疫组织化学实验
• 3.2.5 蛋白含量测定
• 3.2.6 150 细胞中HBsAg 的稳定性研究
• 3.2.7 ELISA 法检测rhIFNα-2b 蛋白表达
• 3.2.8 rhIFNα-26 抗病毒活性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 ELISA 法测定HBsAg 蛋白表达
• 3.3.2 双向琼脂扩散检测小鼠血清中HBsAb 浓度
• 3.3.3 Western blotting 法检测HBsAg 蛋白表达
• 3.3.4 免疫组织化学实验结果
• 3.3.5 总蛋白含量测定结果
• 3.3.6 150 细胞中HBsAg 的稳定性研究
• 3.3.7 150 细胞中rhIFN-α2b 抗病毒活性测定结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 150细胞免疫效果的初步研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 免疫BALB/C 小鼠
• 4.2.2 ELISA 法检测小鼠血清HBsAb
• 4.2.3 BALB/C 小鼠淋巴细胞转化实验
• 4.2.4 细胞因子检测
• 4.2.5 口服给药免疫家兔
• 4.2.6 ELASA 法检测家兔血清HBsAb
• 4.3 结果
• 4.3.1 ELISA 法检测小鼠血清HBsAb 结果
• 4.3.2 BALB/C 小鼠淋巴细胞转化实验结果
• 4.3.3 细胞因子检测结果
• 4.3.4 ELASA 法检测家兔血清HBsAb 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文及科研业绩
• 论文摘要
• 英文摘要
• 致谢