文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的基因克隆与表达及重组蛋白活性的测定

论文摘要

铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD）在生物体中参与诸多生物事件,不但参与氧自由基的清除以及防御分子损伤和机体衰老,还参与信号传递和神经存活,是活性氧清除酶系中最重要的酶。本研究利用实验室已有的SMART全长cDNA文库,克隆得到了文蛤Cu/Zn-SOD的全长cDNA序列,该序列全长为1 388bp, 5′UTR为50bp,3′UTR为876bp,开放阅读框长度为462bp,编码153个氨基酸。二级结构以无规则卷曲为主约占59.85%,此外还有螺旋结构约占7.3%,延伸链约占32.85%。亚细胞定位时,未发现信号肽,和跨膜区,说明文蛤Cu/Zn-SOD不是分泌蛋白也不是膜蛋白,为胞质蛋白。高级结构分析发现,该基因的结构中心为8条反向平行的β折叠够成的β-桶,α螺旋较少,存在4个Cu原子结合位点（His46、His48、His63、Hisll9）,4个Zn结合位点（His63、His71、His80、Asp83）,Cu、Zn共同连接His63组成“咪唑桥”结构,该结构特征完全符合胞内Cu/Zn-SOD的结构特征。因此认为本研究得到的Cu/Zn-SOD为胞内Cu/Zn-SOD。通过几种贝类Cu/Zn-SOD的多序列比对,文蛤Cu/Zn-SOD与近江牡蛎等其他9种海洋贝类的Cu/Zn-SOD具有较高的同源性,但是在Cu/Zn-SOD的进化树中,既有相同科的物种聚在一起的,也有相同科的物种不聚在一起的,该基因并不严格按照其所属物种的进化而进化,说明存在于这些物种中的Cu/Zn-SOD高度保守,不适于用作分类基因。用鳗弧菌（Vibrio anguillarum）刺激健康文蛤,通过real-time PCR进行定量检测,发现未受菌刺激的胞内Cu/Zn-SOD基因表达量最低,但随着刺激时间的延长表达量逐渐增大,刺激6个小时的胞内Cu/Zn-SOD基因表达量达到最大,6个小时以后表达量开始下降,32个小时后表达量趋于稳定。这表明胞内Cu/Zn-SOD基因参与了鳗弧菌刺激后产生的过量超氧阴离子自由基的消除过程。在大肠杆菌中重组表达的文蛤Cu/Zn-SOD蛋白质具有生物学活性,在10-30℃的温度之间,其生物学活性可保持在60%以上,90℃时完全失活;在pH值为7.4时,Cu/Zn-SOD基因的重组蛋白活性最高,pH值为12.2时才失去生物学活性,因此认为Cu/Zn-SOD是一种稳定的酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 文蛤养殖现状及分子生物学研究进展
• 1.1.1 我国文蛤养殖现状
• 1.1.2 文蛤的分子生物学研究
• 1.2 铜锌超氧化物歧化酶基因研究现状
• 1.2.1 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的发现与种类
• 1.2.2 Cu/Zn-SOD 的结构特征
• 1.2.3 Cu/Zn-SOD 的理化性质
• 1.2.4 影响Cu/Zn-SOD 活性的因素
• 1.3 本研究的意义
• 2 文蛤胞内铜锌超氧化物岐化酶基因的克隆与序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 结果
• 2.3.2 讨论
• 2.4 小结
• 3 文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的时序表达与组织分布表达
• 3.1 前言
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验步骤
• 3.2.3 Real-time PCR
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 小结
• 4 文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的体外重组表达与活性鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 载体构建
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 构建克隆载体PMD-Mm-Cu/Zn-SOD
• 4.2.3 构建表达载体PET-Mm-Cu/Zn-SOD
• 4.3 诱导
• 4.3.1 诱导培养
• 4.3.2 超声破碎
• 4.3.3 煮样
• 4.4 蛋白电泳
• 4.4.1 电泳液制备
• 4.4.2 制胶（BIO-RAD）
• 4.4.3 电泳
• 4.4.4 染色
• 4.4.5 大量诱导
• 4.5 蛋白纯化
• 4.5.1 配制蛋白纯化所用Buffer
• 4.5.2 预处理
• 4.5.3 过柱子
• 4.5.4 透析
• 4.6 重组表达蛋白活性测定
• 4.6.1 纯化蛋白的定量
• 4.6.2 酶活测定
• 4.7 结果与讨论
• 4.7.1 诱导表达结果与讨论
• 4.7.2 活性测定结果与讨论
• 4.7.3 温度及pH 对文蛤铜锌超氧化物歧化酶活性的影响
• 4.8 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢