孕酮诱导HOXa-10基因表达及转基因猪制备研究

论文摘要

母猪产仔数是衡量母猪生产力非常重要的指标,也是决定养殖业经济和社会效益的关键因素之一。传统育种耗时长限制性较大,而更准确更有预见性的转基因育种技术是传统育种技术的延伸与突破,也可大大缩短育种周期,加快育种进程。经研究表明,HOXa-10基因对生殖系统的发育、子宫内膜形态构建、胚胎发育、子宫容受性的建立、胚胎定位及附植等发挥重要作用,且受雌激素、孕激素和白血病抑制因子等多种因素调控。本实验选取与繁殖性状密切相关的HOXa-10基因作为研究对象,采用孕酮注射诱导HOXa-10基因表达以及采用显微注射转基因猪制备及在染色体水平的检测的研究,主要获得以下结果：1、妊娠期小鼠注射孕酮激素提高HOXa-10基因的表达研究。从小鼠怀孕起,通过腹腔对小鼠进行孕酮注射,提取子宫内膜RNA进行RT-PCR分析发现,在妊娠第4天注射4 mg孕酮与未处理正常小鼠相比,HOXa-10基因差异表达显著升高（P<0.05）,注射2 mg孕酮组HOXa-10基因的表达与正常小鼠差异不显著；而在第5天注射2 mg（P<0.05）与4mg（P<0.05）和未处理正常妊娠小鼠相比,HOXa-10基因差异显著,在妊娠第6天,注射孕酮与正常妊娠的小鼠HOXa-10基因表达差异不显著。上述研究表明在小鼠妊娠期,HOXa-10基因上调表达受孕酮调控,在小鼠胚胎附植期增加孕酮浓度可以上调HOXa-10基因表达,但是在附植结束后,孕酮对HOXa-10的表达不起作用,可能孕酮仅对在附植期间的HOXa-10表达起作用。2、采用原核受精卵显微注射方法,手术取卵直接移植,总共移植13头受体母猪,总计移植1细胞胚胎260个,2细胞胚胎68个,合计328个胚胎,平均每头受体母猪移入胚胎数25.23个。最终3头受体猪妊娠足月分娩,共产仔19头,其中1头木乃伊死胎,3头弱仔。妊娠率为23.08%,胚胎正常生长发育并能长成猪仔出生率为5.79%。3、转基因阳性猪检测采用PCR和Southern杂交技术,从19个仔猪样品中,通过在载体启动子CMV区域和第一外显子设计引物,检测得到PCR阳性猪1头；而Southern杂交探针标记在特异CMV启动子上,得到阳性1头,两者检测结果相同。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 HOXa-10基因的研究进展
• 1.2.1 HOXa-10基因概述
• 1.2.2 HOXa-10基因功能研究进展
• 1.3 孕酮诱导HOXa-10基因表达的研究现状
• 1.4 转基因动物研究进展
• 1.4.1 转基因动物发展简史
• 1.4.2 转基因动物制作方式
• 1.4.2.1 原核显微注射法（Pronuclear microinjection）
• 1.4.2.2 病毒载体法（Retroviruses）
• 1.4.2.3 精子介导法（Sperm-mediated gene transformation）
• 1.4.2.4 胚胎干细胞介导法（Embryonic stem cell-mediated）
• 1.4.2.5 体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer）
• 1.4.2.6 转座子介导转基因（Transposon-mediated）
• 1.4.2.7 基因打靶的转基因方法（Gene targeting）
• 1.4.2.8 人类人工染色体法（Human artificial chromosome）
• 1.4.2.9 锌指核酸酶介导转基因（Zinc finger nuclease-mediated）
• 1.4.3 转基因动物的检测方法
• 1.4.3.1 基因染色体水平的检测
• 1.4.3.2 转录水平的检测
• 1.4.3.3 翻译水平的检测
• 1.4.3.4 表型水平的检测
• 1.4.4 转基因动物育种研究的意义
• 2 研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验样品
• 3.1.1.1 用于HOXa-10基因孕酮诱导表达的样品
• 3.1.1.2 用于转基因猪制备及检测的样品
• 3.1.2 主要试剂及配制
• 3.1.2.1 引物
• 3.1.2.2 孕酮注射所需主要试剂
• 3.1.2.3 转基因猪制备所需主要试剂及配置
• 3.1.2.4 转基因猪检测所需主要试剂及配置
• 3.1.2.5 其他常规试剂与药品
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 研究技术路线
• 3.2.1.1 小鼠孕酮注射后子宫内膜HOXa-10基因表达
• 3.2.1.2 转HOXa-10基因猪的制备与检测
• 3.2.2 小鼠孕酮注射
• 3.2.2.1 样品准备
• 3.2.2.2 小鼠子宫内膜RNA提取
• 3.2.2.3 总RNA的反转录
• 3.2.2.4 实时定量PCR
• 3.2.3 转基因猪制备
• 3.2.3.1 实验用猪的筛选
• 3.2.3.2 母猪的超数排卵
• 3.2.3.3 原核胚胎的获取
• 3.2.3.4 显微注射
• 3.2.3.5 受体母猪手术移植
• 3.2.3.6 妊娠产仔
• 3.2.4 转基因猪检测
• 3.2.4.1 样品采集
• 3.2.4.2 猪总DNA提取
• 3.2.4.3 PCR检测
• 3.2.4.4 Southern杂交
• 4 结果
• 4.1 小鼠孕酮注射诱导子宫内膜HOXa-10基因的表达
• 4.1.1 小鼠子宫内膜RNA的提取
• 4.1.2 小鼠子宫内膜RNA的反转录
• 4.1.3 小鼠HOXa10基因定量PCR检测结果
• 4.2 转基因猪制备
• 4.3 转基因猪检测
• 4.3.1 转基因猪PCR初步鉴定
• 4.3.2 转基因猪的Southern blot鉴定
• 5 讨论
• 5.1 关于小鼠孕酮注射后子宫内膜HOXa-10基因表达变化情况
• 5.1.1 孕酮对HOXa-10调控机制
• 5.1.2 HOXa-10表达调控机理
• 5.2 转HOXa-10基因猪的制备
• 5.2.1 转HOXa-10基因的意义
• 5.2.2 转基因方法与效率
• 5.2.3 转HOXa-10基因与猪繁殖性状的改良
• 5.3 转HOXa-10基因猪的鉴定
• 5.3.1 转基因鉴定的方法选择
• 5.3.2 转基因鉴定与安全
• 5.3.3 转HOXa-10基因前景与挑战
• 6 小结
• 6.1 本研究的主要成果与结论
• 6.2 本研究的创新点与特色
• 6.3 本研究的不足及下一步工作建议
• 参考文献
• 致谢