遗传改造Zymomonas mobilis代谢木糖及其木糖醇产生机制的研究

论文摘要

资源和环境问题是人类当前面临的最主要的挑战。生物资源是地球上最丰富的可再生性资源。随着矿产资源日渐枯竭,开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术,生产生物燃料,具有极其重要的意义和光明的发展前景。木质纤维素原料转化生产燃料酒精是被公认为最有发展前景的可再生清洁能源技术之一。木糖是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分,在木质纤维原料水解液中占30%左右。因此,木糖的有效生物转化利用是实现木质纤维素转化生产乙醇的关键之一。属于厌氧型细菌的运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）是自然界中迄今为止唯一已知的将丙酮酸脱羧酶及乙醇脱氢酶与独特的Enter-Doudoroff（ED）糖酵解途径相偶联高效产生乙醇的微生物。它具有酒精产率高、酒精耐受力强、副产物少等优点。但与酿酒酵母相似,运动发酵单胞菌的底物利用范围有限,除葡萄糖、果糖和蔗糖外,由于自身缺少必要的木糖代谢途径而无法利用木质纤维素水解产生的木糖等戊糖成分,从而限制了其在酒精发酵生产中的应用。虽然之前已有成功地遗传改造运动发酵单胞菌使其代谢利用木糖的研究报道,但由于所构建重组菌大多受专利保护,且在发酵过程中存在着副产物木糖醇抑制、木糖运输速率低、胞内能量丢失等问题的影响,使其代谢利用木糖产乙醇的效率不是很高。因此本论文拟通过代谢工程手段改造运动发酵单胞菌以获得能够代谢利用木糖的重组菌株,并以此为基础,阐明副产物木糖醇的形成机制;初步构建葡萄糖促扩散蛋白介导木糖运输机制分析及进化改造的平台,为进一步改进菌株的木糖发酵性能奠定基础。本论文的主要研究内容如下:1.遗传改造Z.mobilis代谢利用木糖对自然界中能够利用木糖的微生物代谢途径研究发现,木糖可通过磷酸戊糖途径而与ED途径相偶联,其中木酮糖是磷酸戊糖途径的一个重要中间产物。木酮糖可以进一步通过木酮糖激酶、转酮酶和转醛酶的作用而进入ED途径生成酒精。运动发酵单胞菌正是因为缺少相关的磷酸戊糖途径成分而无法代谢利用木糖。因此,本文通过代谢工程手段,将负责木糖代谢转化的木糖异构酶基因（xylA）和木酮糖激酶基因（xylB）置于强组成型启动子3-P-甘油醛（Pgap）下;同时将负责木糖转化利用的转醛醇酶（talB）和转酮醇酶基因（tktA）置于强组成型启动子烯醇酶（Peno）下,通过电转的方式将上述四个基因转入到Zymomonasmobilis CP4中,从而在运动发酵单胞菌中构建起一套完整的木糖代谢途径。实验结果表明,重组运动发酵单胞菌显示出所有四种酶的活性,由此获得一株能够代谢利用木糖的重组菌株Z.mobilis CP4（pBBR-xy1）。2.重组菌Z.mobilis CP4（pBBR-xy1）木糖发酵测试对构建的重组菌Z.mobilis（pBBR-xy1）木糖发酵能力进行了测试。在3.2%葡萄糖和3.4%木糖（发酵液中实际糖浓度）混合碳源条件下发酵,重组菌最终产生19.5g/L乙醇。其中,木糖利用率为32.3%,总糖利用率为65.36%,乙醇产率为理论值（以总糖计算）的57.6%。本论文构建的重组菌虽然可能受副产物木糖醇抑制、木糖运输、胞内能量等因素的影响不能高效代谢木糖产乙醇,但是具有了代谢利用木糖产乙醇的能力,为进一步通过其它手段包括代谢组学分析,调整改进细胞整体代谢流向及能量与氧化还原状态平衡,从而改进菌株的木糖发酵性能奠定了一个良好的基础。3.副产物木糖醇形成机制的研究我们通过HPLC分析发酵产物时,在有木糖作为碳源的发酵液中检测到了木糖醇的生成（约1.29g/L）。据相关研究报道分析,副产物木糖醇在木酮糖激酶（xylB）的作用下会生成5-P-木糖醇,而5-P-木糖醇的积累对细胞的生长有很大的毒害作用。当发酵液中木糖醇的添加浓度达到5g/L时,重组菌的生长就被完全抑制。因此,木糖醇的形成累积是影响重组菌菌体生长速率、菌体量和乙醇产量的重要因素之一。但到目前为止,Z.mobilis中木糖醇的产生机制尚不清楚。通过研究发现,Z.mobilis中的葡萄糖果糖氧化还原酶（GFOR,广泛存在于周质空间中并催化果糖还原生成山梨醇）介导了木糖还原生成木糖醇的反应(产山梨醇vs产木糖醇的比酶活为68.39μmol min-1mg-1 vs 1.102μmol min-1mg-1)。GFOR对木糖的作用机制总体上类似于其将果糖还原生成山梨醇的乒乓反应机制,但在某些细节上又有所不同:反应过程中,木糖醇的产量随底物浓度的变化曲线呈现典型的“S”型曲线,并且其协同系数为2,遵循正协同反应机制;进一步研究发现葡萄糖、果糖和木糖竞争同一个底物结合位点;通过对突变体Y269F和S116D的酶活研究发现,其以葡萄糖和木糖为底物反应的变化趋势与以葡萄糖和果糖为底物反应的变化趋势完全一致,由此说明GFOR催化木糖还原的分子机制和催化果糖还原的分子机制是相同的。GFOR体外催化木糖还原生成木糖醇的发现,暗示了它是Z.mobilis中木糖醇生成的重要途径。美国国家能源部于2008年11月的相关申请专利（USPTO patent application:20080286870）从遗传学角度发现木糖醇主要是由GFOR所介导产生的,并且报道GFOR缺失的重组菌对木糖的利用率明显增加,乙醇的产量也显著提高。通过本论文的体外研究实验和美国国家能源部的体内实验可以确认,在Z.mobilis中,GFOR是介导木糖醇产生的主要途径。通过消除副产物木糖醇的影响,应该可以显著提高重组菌的木糖利用率和乙醇产量。4.葡萄糖促扩散蛋白介导木糖运输机制分析及进化改造平台初建研究发现,代谢利用木糖的重组运动发酵单胞菌中木糖和葡萄糖都是在葡萄糖促扩散蛋白（glucose facilitator protein,GLF）的协助下,在不需要消耗ATP的条件下以促进扩散的方式进入胞内的,但由于GLF对葡萄糖的亲和力（Km=4.1 mM）大于对木糖的亲和力（Km=40 mM）,所以在葡萄糖和木糖同时存在时,GLF可能会优先运输葡萄糖,待葡萄糖代谢消耗完毕之后才开始运输木糖,从而影响木糖的利用速率和乙醇的产率。已知GLF是运动发酵单胞菌向胞内运输糖类的唯一载体,推测其在运动发酵单胞菌的木糖运输方面也起着重要作用。本文通过同源重组将大肠杆菌ZSC112ΔptsHI-crr（由于缺少PTS系统相关酶及葡萄糖激酶而既不能运输也不能磷酸化葡萄糖）中与木糖转运相关的xylF、xylG和xylH基因敲除,获得了一株既不能转运利用葡萄糖也不能转运利用木糖的缺陷型菌株ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh;并进一步将运动发酵单胞菌的GLF-GLK（葡萄糖促扩散蛋白-葡萄糖激酶）基因转入上述缺陷菌株中,得到的重组菌能重新利用葡萄糖和木糖生长,这说明运动发酵单胞菌中的glf和glk可在功能上弥补大肠杆菌中的葡萄糖转运（PTS途径）的缺陷;此外,在木糖转运途径（xylFGH缺失）被阻断的情况下,glf能够弥补大肠杆菌中木糖转运途径的缺陷,这直接证明了glf能够介导木糖的转运。由此我们得到了一株葡萄糖和木糖代谢缺陷型的ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh菌株,并通过将运动发酵单胞菌的GLF-GLK（葡萄糖促扩散蛋白-葡萄糖激酶）基因转入到缺陷菌株从而构建了一株便于研究GLF不同糖转运特性的模式菌株。此菌株为进一步对通过化学诱变或易错PCR方法构建的GLF-GLK突变库进行筛选,以获得能同时高效吸收利用葡萄糖和木糖的GLF突变蛋白打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第一章 绪论
• 1.1 燃料乙醇的应用和发展
• 1.1.1 传统方式的乙醇生产所面临的问题
• 1.1.2 木质纤维素发酵生产乙醇的现状及前景
• 1.2 代谢利用木糖产乙醇的菌株
• 1.2.1 自然界中利用木糖发酵产生乙醇的菌株
• 1.2.2 木糖代谢途径
• 1.2.3 酵母菌的木糖代谢工程改造
• 1.2.4 大肠杆菌木糖代谢产生乙醇的遗传工程改造
• 1.3 运动发酵单胞菌代谢产乙醇的代谢工程改造
• 1.3.1 运动发酵单胞菌的基本特征
• 1.3.2 Z.mobilis的基因组序列
• 1.3.3 重组Z.mobilis代谢木糖产乙醇的研究进展
• 1.4 副产物木糖醇对重组Z.mobilis菌体生长的抑制
• 1.5 葡萄糖果糖氧化还原酶
• 1.6 糖运输
• 1.7 本论文立题依据
• 1.8 本论文主要研究内容
• 第二章 代谢木糖重组Zymomonas mobilis的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 分子生物学方法
• 2.2.2 感受态制备
• 2.2.3 运动发酵单胞菌电转化方法
• 2.2.4 粗酶液制备
• 2.2.5 蛋白质含量测定
• 2.2.6 酶活检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 相关基因的克隆及载体的构建
• 2.3.2 pUC19-Pgap-xylA-xylB和pUC19-Peno-talB-tktA重组质粒测序
• 2.3.3 pBBR-Pgap-xylA-xylB-Peno-talB-tktA重组质粒的构建
• 2.3.4 运动发酵单胞菌的电转化
• 2.3.5 重组运动发酵单胞菌验证
• 2.3.6 重组菌Z.mobilis（pBBR-xyl）相关酶活测定
• 讨论
• 本章小结
• 第三章 重组Zymomonas mobilis的木糖发酵
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 生长曲线的测定
• 3.2.2 葡萄糖木糖共发酵实验操作
• 3.2.3 发酵产物的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Z.mobilis CP4和Z.mobilis（pBBR-xyl）的葡萄糖发酵
• 3.3.2 Z.mobilis CP4和Z.mobilis（pBBR-xyl）葡萄糖和木糖共发酵
• 3.3.3 Z.mobilis CP4和Z.mobilis（pBBR-xyl）的木糖发酵
• 讨论
• 本章小结
• 第四章 Zymomonas mobilis中木糖醇形成机制的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 分子生物学方法
• 4.2.2 BL21感受态制备
• 4.2.3 蛋白的表达
• 4.2.4 粗酶液的制备
• 4.2.5 蛋白的纯化
• 4.2.6 蛋白质含量的测定
• 4.2.7 酶活检测
• 4.2.8 GFOR催化反应相关常数的测定
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 相关基因的克隆及载体的构建
• 4.3.2 蛋白的诱导表达及纯化
• 4.3.3 GFOR催化木糖反应产物的鉴定
• 4.3.4 GFOR催化木糖的动力学过程
• 4.3.5 GFOR催化反应过程中底物之间的关系
• 4.3.6 GFOR催化木糖生成木糖醇反应机制的确定
• 讨论
• 本章小结
• 第五章 运动发酵单胞菌葡萄糖促扩散蛋白介导木糖运输机制分析及进化改造平台初建
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 分子生物操作试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 分子生物学方法
• 5.2.2 ZSC112ΔptsHI-crr和ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh感受态制备
• 5.2.3 ZSC112ΔptsHI-crr的转化及敲除
• 5.2.4 ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh的转化
• 5.2.5 ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh（pUC19-glf-glk）在葡萄糖和木糖中的恢复生长
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 葡萄糖木糖代谢缺陷菌株ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh的获取及验证
• 5.3.2 GLF-GLK重组表达质粒构建
• 5.3.3 GLF-GLK对ZSC112ΔptsHI-crr-xylfgh在葡萄糖和木糖碳源上生长缺陷的恢复
• 讨论
• 本章小结
• 全文总结及展望
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的主要学术论文
• 致谢
• 外文写作一
• 外文写作二
• 学位论文评阅及答辩情况表