肝X受体激动剂高通量筛选平台的建立及应用

论文摘要

动脉粥样硬化性心血管疾病被称为发达国家的“头号杀手”,近年来在发展中国家的发病率也越来越高。因此,治疗心血管疾病的新型药物研发已成为国内外的研究热点。大量研究表明,肝X受体（liver X receptors, LXRs）在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键性作用。因此,以LXRs为靶点寻找抗动脉粥样硬化的药物,对心血管疾病的治疗具有重要意义。肝X受体是核受体家族中的一员,最初被认为是孤儿受体,之后发现氧化固醇及其衍生物是它的天然配体。LXRs与RXR结合后可调节其靶基因的转录。LXRs作为胆固醇感受器,可以调节包括胆固醇流出、转运、排泄等大量与胆固醇代谢有关的基因的表达。最近几年,LXRs又被发现是脂代谢和糖代谢的关键转录调节因子。另外,LXRs在巨噬细胞和系统水平均有抗炎作用。最近的研究表明LXRs激动剂在脑和中枢神经系统中对免疫和胆固醇稳态也有作用。因此,LXRs有望作为治疗动脉粥样硬化、高胆固醇血症、Ⅱ型糖尿病等的药物靶点。高通量筛选（High Throughput Screening, HTS）技术是一种新型药物筛选和研发技术,广泛用于相关的生物或化学领域。该技术通过自动化操作系统执行实验过程,用灵敏快速的检测仪器采集实验数据,用计算机对实验获得的数据进行分析处理,可以在同一时间内对数以万计的化学合成分子及天然化合物进行检测,以实现快速筛选出调节某一特定生理过程的活性化合物的目的。为了开发新的预防和治疗动脉粥样硬化的候选药物,本研究基于报告基因的方法建立了一个包括四个报告基因方法的LXRs（?）目关的激动剂高通量筛选平台及活性评价体系。用于微生物来源的次生代谢产物、天然或合成的化合物的高通量药物筛选和活性评价。本研究从肝细胞中提取mRNA并反转录成cDNA,以此为模板扩增出LXRβ基因片段,构建成融合表达质粒pBIND-LXRp, pTARGET-LXRβ。以U937细胞基因组为模板,成功克隆了ABCA1基因的上游调控序列ABCA1 promoter,并连接到pGL3载体上,构建了报告质粒pGL3-ABCA1（promoter）-Luc。将含有4个拷贝的LXRE片段连接到pGL3载体上,构建了报告质粒pGL3-4×LXRE-Luc。通过不同表达质粒和报告质粒的共转染建立了四种LXRs激动调节剂药物筛选模型,利用已知的肝X受体的激动剂TO901317作为阳性药对四个高通量筛选模型进行检验,结果表明TO901317可以剂量依赖性的诱导萤光素酶基因的表达,并具有较高的信号本底比。在四个筛选模型中,信号本底比在3.47-6.16之间,Z’因子在0.42-0.71范围内,EC50值分别为13.5μM、19.7μM、8.9μM、9.4μM。利用所构建的LXRs激动剂高通量筛选模型对华北制药集团新药公司的微生物次生代谢产物库和单体化合物库进行了3870样次的筛选。经初筛和复筛共得到7个活性化合物。分别为：Asperazine,3’4’,5’,7’-tetrahydroxy-8-methoxy isoflavone, Herbimycin A, Oxepinamide D,染料木素（genistein）, BY-16,多肽H-3。对于筛选出的7个活性化合物,又进行了细胞水平的药效评价。结果表明这些化合物可以诱导LXRs靶基因的表达,可以抑制巨噬细胞中炎性因子一氧化氮的产生,且对细胞膜毒性均较小。这些研究表明以上化合物均具有抗动脉粥样硬化和抗炎的作用。总之,本研究建立了一个肝X受体激动剂的高通量筛选平台和药效评价体系,并得到了7个活性化合物。该体系的应用将为动脉粥样硬化以及其他LXRs相关疾病的药物研发打下良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 研究技术路线见图
• 1 肝X受体及其配体的研究进展
• 1.1 LXRs结构、分型、分布
• 1.2 LXRs转录激活过程
• 1.3 LXRs的靶基因
• 1.3.1 与胆固醇代谢有关的靶基因
• 1.3.2 与磷脂和胆固醇流出有关的靶基因
• 1.3.3 与甘油三酯代谢有关的靶基因
• 1.3.4 与脂肪酸合成有关的靶基因
• 1.3.5 其他靶基因
• 1.4 LXRs的研究意义
• 1.4.1 LXRs与动脉粥样硬化
• 1.4.2 LXRs与Ⅱ型糖尿病
• 1.4.3 LXRs与阿尔茨海默病
• 1.4.4 LXRs与高血压
• 1.4.5 LXRs与肿瘤
• 1.4.6 LXRs与胆结石
• 1.4.7 LXRs与其他疾病
• 1.5 LXRs的配体及应用
• 1.5.1 天然配体
• 1.5.2 人工激动剂
• 1.6 展望
• 2 模型的构建及应用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料与仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果分析
• 2.2.1 模型的构建
• 2.2.2 模型的验证
• 2.2.3 筛选结果及化合物的活性研究
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录 缩略语一览表
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单