油菜（Brassica napus）miRNA的鉴定及Bna-miR1140表达调控机制研究

论文摘要

miRNAs（microRNA）是一类在进化上保守的长约21nt的非编码单链RNA，在基因表达调控的网络中处于核心位置，高效的调控其靶基因的翻译或表达，在生物体生长发育、抵抗生物或者非生物胁迫以及在生物体代谢途径中起着非常重要的作用。在短短的10年时间内，植物miRNAs的研究取得了突飞猛进的成果，成为一个新的研究领域。油菜（rape or rapeseed）作为世界性的重要油料作物，研究其miRNA所参与的遗传控制机理，对于培育理想油菜品种，增加油菜产量和降低油菜生产成本具有重要意义。鉴于目前对油菜miRNAs及其靶基因的研究报道还很少，且sanger数据库中可参考的miRNAs信息也仅仅48条，本研究对甘蓝型油菜（Brassica napus）栽培种Westar材料进行小RNA测序及降解组分析，鉴定新的油菜miRNAs，寻找已知miRNAs和新发现的miRNAs的靶基因，并对芸薹属独特的miRNA家族Bna-miR1140进行表达调控机制研究，以期为油菜品种改良和油菜miRNAs调控机制的研究提供理论依据。主要结果如下：1.鉴定获得了41个新的保守油菜miRNAs以及67个芸薹属特有的新候选miRNAs，其中包括20个miRNAs*序列。利用实时荧光定量RT-PCR技术验证了测序结果。并将新发现的miRNAs提交miRBase数据库。2.依据NCBI中现有的油菜EST和基因组数据，利用targetfinder软件预测了油菜miRNAs靶基因，分别获得保守的miRNAs和特异的新候选miRNAs靶向的基因113个和84个。其中Bna-miR1140的潜在靶基因为一种糖基转移酶（glycosyltransferase）和响应调节因子（Arabidopsis response regulator ARR8-likeprotein）。3.克隆得到了油菜Bna-miR1140基因前体197bp的片段，构建了植物过表达载体35S::Bna-miR1140，通过农杆菌介导法浸染油菜子叶柄转化甘蓝型油菜栽培种Westar。获得了14个PCR阳性植株，其中有5株株型特异，表现双主序表型，分枝数明显增多，其他9株阳性株均与野生型油菜表型一致，推测可能与表达强度有关。调查了株型特异的5个株系T1代表型分离情况，经卡方检验发现其中有4个株系的株型变异遗传符合3:1的孟德尔分离规律。初步推测油菜Bna-miR1140可能参与调控了油菜的分枝发育。4.分离得到了油菜Bna-miR1140基因上游1351bp的序列，利用plantCARE在线软件对启动子序列的顺式作用元件进行在线分析，该启动子含有与转录必需的RNA聚合酶结合的TATA盒以及在调控基因转录效率中发挥重要作用的CAAT盒，并进一步构建了miR1140pro::GUS植物表达载体。通过农杆菌介导法转化油菜，得到5株PCR阳性植株，对转基因植株的根、茎、叶、叶腋（茎尖分生组织，SAM）、叶柄、花、种荚等组织和器官进行GUS染色分析，结果表明GUS仅在叶柄及叶腋中表达，这与Bna-miR1140体内表达的结果一致，进一步佐证了Bnas-miR1140与调控油菜的分枝发育相关。综上所述，本研究采用深度测序和降解组分析技术鉴定了一批油菜的miRNA，并对其靶基因进行了分析和预测。对油菜特有的小RNABna-miR1140进行了较深入的研究，转基因结果初步表明miR1140参与了油菜分枝的发育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 绪论
• 第一章 文献综述
• 1 miRNA的定义及发现
• 2 miRNA 的产生机理和作用机制
• 2.1 miRNA 的产生机理
• 2.2 miRNA 的作用机制
• 3 miRNA 的鉴别和分离
• 3.1 传统方法
• 3.2 高通量测序技术
• 3.3 小分子 RNA 高通量 Solexa 测序技术原理
• 4 miRNA 靶基因的检测
• 4.1 生物信息学预测
• 4.2 miRNA 芯片技术
• 4.3 降解组测序法
• 5 植物 miRNA 的生物学功能研究
• 5.1 miRNA 在植物生长发育过程中的功能
• 5.2 miRNA 参与植物激素的信号传导
• 5.3 miRNA 参与植物的逆境应答
• 5.3.1 参与非生物胁迫应答
• 5.3.2 参与生物胁迫应答
• 5.4 miRNA 参与自身的生物合成途径的调控
• 6 本研究的目的意义
• 第二章 利用 Solexa 技术鉴定油菜新 miRNA
• 1 实验材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 RNA 的提取及用于 Solexa 测序的 sRNA 文库和降解组 cDNA 文库构建
• 1.2.2 生物信息学分析
• 1.2.3 甘蓝型油菜 miRNAs 的终点 PCR 和实时荧光定量 PCR 分析
• 2 结果与分析
• 2.1 利用 Solexa 技术测序甘蓝型油菜 miRNAs
• 2.2 甘蓝型油菜保守 miRNAs 的鉴定
• 2.3 芸薹属新候选的 miRNAs
• 2.4 茎环 qRT-PCR 验证甘蓝型油菜 miRNAs
• 2.5 油菜保守 miRNAs 的靶基因
• 2.6 芸薹属新候选的 miRNA 靶基因
• 3 讨论
• 第三章 油菜 Bna-miR1140 基因的分离与过表达分析
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 酶、试剂盒和主要的化学试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总 RNA 的提取及纯化
• 1.2.3 油菜 RNA 的反转录
• 1.2.4 油菜 Bna-miR1140 基因前体片段的克隆
• 1.2.5 构建油菜 Bna-miR1140 基因植物过表达载体
• 1.2.6 农杆菌 LBA4404 电击感受态制备及 35S::Bna-miR1140 质粒转化农杆菌
• 1.2.7 油菜的转化及阳性植株鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 油菜叶、叶柄、茎、根和芽总 RNA 的提取
• 2.2 油菜 Bna-miR1140 基因前体片段的获得
• 2.3 油菜 Bna-miR1140 基因植物过表达载体的构建及农杆菌转化
• 2.4 过表达载体 35S::Bna-miR1140 转化油菜和转基因苗筛选
• 2.5 转化 35S::Bna-miR1140 油菜株的 PCR 鉴定
• 2.6 转化 35S::Bna-miR1140 油菜株 T0 代表型分析
• 2.7 转化 35S::Bna-miR1140 油菜株 T1 代田间表型分析
• 3 讨论
• 第四章 油菜 Bna-miR1140 启动子 miR1140Pro 的克隆与表达模式研究
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 酶、试剂盒和主要的化学试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 油菜基因组 DNA 的提取
• 1.2.3 Bna-miR1140 启动子的克隆
• 1.2.4 构建油菜 miR1140 Pro::GUS 植物表达载体
• 1.2.5 miR1140 Pro::GUS 质粒转化农杆菌 LBA4404 及农杆菌阳性重组子的鉴定
• 1.2.6 miR1140 Pro::GUS 转化油菜和 T0 代阳性株 PCR 鉴定
• 1.2.7 转 miR1140 Pro::GUS 油菜 T1 代阳性株组织化学染色
• 2 结果与分析
• 2.1 油菜 Bna-miR1140 启动子片段的获得
• 2.2 油菜 Bna-miR1140 启动子植物表达载体的构建及农杆菌转化
• 2.3 miR1140 Pro::GUS 转化油菜及 T0 代阳性株的获得
• 2.4 转 miR1140 Pro::GUS 油菜 T1 代阳性株组织化学染色鉴定
• 3 讨论
• 第五章 全文结论和创新点及研究展望
• 1 主要结论
• 1.1 油菜新 miRNAs 及其靶基因的鉴定
• 1.2 油菜 Bna-miR1140 基因的分离与过表达
• 1.3 油菜 Bna-miR1140 启动子的克隆与调控模式
• 2 本项目的特色与创新点
• 3 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在学期间发表的文章
• 导师评阅表