EDFs技术的探索与甘蓝S基因的定位研究

论文摘要

当第一个S位点基因发现之后,对于它在植物中自交不亲和信号转导途径中的研究就成为热点。现在的研究结论已经得出,控制自交不亲和性的S-locus的三种基因为SLG、SCR/SP11及SRK,在芸苔属植物传代中紧密连锁遗传。作为一个芸苔属物种,甘蓝具备它们所共有的特征:染色体过于短小而且包装致密。由此,单拷贝或者低拷贝的杂交定位反应难以在甘蓝细胞内进行,针对S-locus在甘蓝基因组中的具体位置的研究至今却没有定论。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）的建立,使得S-locus在染色体上的定位成为可能。S-locus在甘蓝基因组中可能以单拷贝形式存在,这对于甘蓝染色体短小的特征而言,确立单个拷贝位点的准确位置有较大的难度。于是我们选择EDF-FISH（extended DNA fiber FISH）,首先将染色体伸展开,然后在伸长的DNA纤维上进行原位杂交确定S-locus的位置。然而,传统上采用提取间期细胞核制备EDFs的方法在以甘蓝为材料的实验中并不是非常有效。论文主要的内容是:针对以芸薹属植物甘蓝为代表的小型染色体植物物种,尝试并比较多种实验方法和技术来降低DNA分子的包装程度,增加其直线上的距离来制备EDFs,同时探索性的创建了一种简便易行的EDF制备方法,进而以甘蓝S基因座的两种基因为探针在甘蓝粗线期染色体和EDFs进行荧光原位杂交,根据杂交的结果对新建立的EDFs制备技术的可行性以及高效性检验,进而获取甘蓝的S位点的物理图谱,并深入的分析S位点在甘蓝单倍体基因组中的拷贝数。本研究以西南农业大学繁育的典型性自交不亲和的结球甘蓝2003al及羽衣甘蓝K14、K37和K39为材料,利用间期细胞核染色质梳理伸长处理和中期染色体拉伸制备制备EDFs,并与新创建的EDFs制备技术的伸长效果相比较,导出了制备DNA纤维最佳效果的伸长技术。为验证制备的EDFs是否适合于运用原位杂交技术进行基因定位进而构建详尽的遗传图谱,利用SRK和SCR/SP11两种探针进行了定性杂交;实验结果也为甘蓝单倍体基因组中S基因的单拷贝性得到了证实;而且将EDF-FISH杂交结果与经过裂解的处理粗线期细胞内原位杂交图谱进行比较分析。简要的实验操作及其实验结果如下:

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摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

1.芸薹属植物自交不亲和性的研究进展

1.1 芸薹属植物自交不亲和相关基因

1.2 SLG、SRK和SCR基因之间的物理距离

2.原位杂交组织化学技术的起源及发展

2.1 染色体制片技术和探针制备技术的进展

2.1.1 染色体制片技术和探针制备技术的发展

2.1.2 探针制备技术的进展

2.2.EDF制备技术的改进与Fiber-FISH的起源与发展

2.2.1 玻片的处理

2.2.2 消化液的功用

2.2.3 制备EDF的选材

2.2.4 DNA纤维的制备

2.3 原位杂交技术在植物研究中的应用

2.3.1 应用于中期及间期细胞遗传学分析

2.3.2 染色体结构变异鉴定

2.3.3 检测基因扩增和缺失

2.3.4 基因或者特异性DNA序列的定位

2.3.5 染色体RNA和基因组进化的研究

第2章引言

第3章材料与方法

（一） extended DNA fibers（EDFs）的制备

1.实验材料

1.1 植物材料

1.2 工具酶和主要的分子细胞遗传学试剂

1.3 常用溶液的配置

2.方法

2.1 载玻片处理

2.2 用于EDF制备的材料的选择

2.2.1 甘蓝游离态中期染色体的制备

2.2.2 甘蓝间期细胞核的获取

2.2.3 前期染色体的制备

2.3 伸长夜最佳成分的选择

2.3.1 蛋白酶K缓冲液最佳成分及其浓度的选择

2.3.2 酶液最适浓度的确定

2.4 制备EDF程序

2.4.1 以中期染色体为材料制备EDF

2.4.2 以间期染色质材料制取EDF

2.4.2 以前期染色体材料制取EDF

（二）荧光原位杂交

1.实验材料和主要药品

1.1 材料

1.2 主要的分子生物学试剂及分子细胞遗传学试剂

1.3 常用溶液的配置

2.方法

2.1 探针的制备

2.1.1 甘蓝基因组DNA的提取（CTAB法提取DNA）

2.1.2 探针的合成与标记

2.2 粗线期染色体的荧光原位杂交

2.2.1 染色体制片

2.2.2 制片的预处理

2.2.3 杂交

2.3 EDF-FISH

第4章结果与分析

1.植物中EDF制备技术的探索

1.1 提高EDF前体粘附率的探索

1.2 EDF前体制备的方法改进效果

1.2.1 游离态中期染色体的制取效果

1.2.2 间期细胞质的提取效果

1.2.3 分裂前期细胞染色体的制取效果

1.3 伸长液的最佳成分的选择

1.3.1 蛋白酶K缓冲液的最佳成分及其浓度的选择

1.3.2 伸长液中酶浓度的选择

2.EDF的制备效果

2.1 利用中期材料制备的EDF

2.2 利用间期材料制备的EDF

2.3 采用前期材料制备的EDF

2.4 小结

3.FISH的结果与分析

3.1 探针的获取

3.1.1 甘蓝基因组DNA的提取

3.1.2 探针的标记

3.2 甘蓝S-locus的定位分析

3.2.1 粗线期染色体中的荧光原位杂交

3.2.2 染色体纤维上的原位杂交

4.论文所需的主要荧光图片

第5章讨论

1.EDFs制备方法的探讨

1.1 制片技术的选择

1.2 伸长液与EDFs的制备效果的关系

1.3 最佳实验材料的选择及EDFs空间分辨率的浅析

2.S基因的定位研究

2.1 硫酸葡聚糖和甲酰胺的用量探索

2.2 DAPI的功用探讨

2.3 甘蓝S基因的定位与EDF-FISH的优势

2.4 甘蓝染色体组与甘蓝型油菜中甘蓝组的异同点的初步探讨

2.5 提高杂交信号检测效率的探索

第6章结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文及参与课题情况

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