论文摘要
羊草（Leymus chinensis）是多年生根茎型禾本科植物,在我国主要分布在东北和内蒙古地区,是广幅旱生草原建群种,具有无性繁殖能力强、生产力高、耐干旱、耐贫瘠、耐盐碱等生物生态学特性。虽然不是典型的盐生植物,但它具有一定的耐盐碱性,在土壤盐分总量0.1～1.0%、pH8.3～10.1的生境上都能正常生长。本文以松嫩平原不同盐碱化草地的羊草为实验试材,研究整个生育期羊草中小分子渗透调节物质脯氨酸、甜菜碱的含量和抗氧化酶超氧化物酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）,以及甜菜碱醛脱氢酶（BADH）活性的动态变化。脯氨酸含量的变化主要受碱化度的影响,甜菜碱含量的变化与土壤电导率成正相关,土壤pH是影响SOD和POD活性变化的主要因子,土壤电导率是影响CAT活性变化的主要因子。从Ⅰ号到Ⅴ号样地总体表现为随着盐碱化程度的加深,甜菜碱、脯氨酸含量、SOD、CAT、POD和BADH活性增加MDA含量下降。植物在受到盐碱胁迫时,体内迅速合成并积累甜菜碱来维持细胞的正常功能,是对外界的一种适应性防御反应。高等植物中,甜菜碱的合成都是由胆碱开始,由胆碱单氧化酶（CMO）和BADH两种酶催化完成。这两种酶都受盐碱和干旱的诱导。CMO、BADH基因是目前耐盐、耐旱基因工程中研究得较多的基因之一。从藜科、禾本科植物碱蓬、玉米等多种植物中已经分离、克隆CMO、BADH基因。关于CMO、BADH同源基因的系统研究在羊草中尚属首次。采用cDNA末端快速克隆技术（RACE）,以不同浓度盐碱溶液处理的羊草幼苗为材料,根据GenBank中发表的黎科和禾本科植物BADH和CMO基因序列,在保守区设计兼并引物进行RT-PCR扩增,分别获得特异条带905bp和520bp。将PCR产物目的片段回收,克隆至T-载体,转化DH-5α受体菌,获得重组质粒,重组质粒经酶切和PCR鉴定后进行测序,经比对后发现,BADH基因与禾本科大麦、小麦的同源性最高,CMO基因与玉米和水稻同源性最高,证明获得了羊草BADH和CMO基因cDNA的中间片段;在此基础上分别进行3′RACE和5′RACE,BADH基因获得3′端序列及5′RACE序列,CMO基因获得3′端序列和5′端序列中间片段上游一段cDNA序列,利用DNAman软件对BADH及CMOcDNA的中间片段、3′端序列及5′端序列进行重叠序列拼接,获得cDNA全长,分别1774bp和1283bp,命名为:LcBADH和LcCMO。在LcBADH cDNA开放阅读框（ORF）两端分别设计含有BamHⅠ和HindⅢ特异引物CS-1和CS-2。PCR获得的羊草LcBADH序列测序分析,包括1521bp的开放阅读框,编码506个氨基酸,分子量56.78kDa。分析其编码的氨基酸中含有十肽VSLELGGKSP,及一个与酶功能有关的Cys为醛脱氢酶高度保守序列,以及C端的SKL。将羊草BADH编码区核苷酸序列与GenBank中已发表的BADH进行比对后,发现与禾本科植物的同源性最高,与大麦的同源性为95%,水稻为91%,短芒大麦草为90%;在LcCMO cDNA序列开放阅读框（ORF）两端分别设计含有BamHⅠ和EcoRⅠ特异引物PLc-1和PLc-2。PCR获得的羊草LcCMO序列测序分析,包括1029bp的开放阅读框,编码343个氨基酸,分子量为37.73kDa。用生物信息学软件DNAman进行分析,与玉米的CMO基因同源性最高,在核苷酸和氨基酸水平上的一致性分别为78.77%和86.54%。将与pGEM-T连接的重组质粒及pET30a（+）分别用BamHⅠ和HindⅢ、BamHI和EcoRI酶切,回收后分别连接,构建表达载体pET30a（+）-LcBADH和pET30a（+）-LcCMO,转化大肠杆菌BL21（DE3）受体菌。在温度为37℃,IPTG终浓度为1mmol/L,不同时间诱导,经SDS-PAGE电泳分析,结果显示LcBADH和LcCMO分别在大肠杆菌中诱导表达,表达蛋白质分子量约为56.78kDa和37.73kDa。