ICAM-1基因多态性与其配体Mac-1单分子力谱的研究

论文摘要

目的：构建细胞间粘附分子-1（ICAM-1）单核苷酸多态性（SNPs）G241R、K469E两个位点的4个单核苷酸突变体，即GK、GE、RK、RE。通过细胞黏附试验观察ICAM-1各突变体与人外周血单个核细胞（PBMCs）发生黏附的改变，并应用原子力显微镜（AFM）研究上述各基因型ICAM-1与其配体Mac-1单分子力谱，以期从分子水平进一步阐明ICAM-1基因多态性与动脉粥样硬化相关疾病的病理生理机制。方法：1构建人ICAM-1基因定点突变真核表达载体0.1%I型胶原酶37℃消化人脐静脉内皮15-20分钟，分离获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。从HUVEC中提取总RNA，根据人ICAM-1cDNA序列设计合成一对PCR引物，并在其两端引入BamHI和HindIII酶切位点。通过RT-PCR获得野生型ICAM-1（ICAM-1-GK）cDNA编码区全长序列，DNA测序。在突变位点设计引物，采用重叠延伸PCR定点诱变技术由ICAM-1-GK突变获得其氨基酸241及469位点的单核苷酸突变体ICAM-1-GE、ICAM-1-RK、ICAM-1-RE的编码区DNA序列，进行DNA测序。将各基因型的ICAM-1编码区DNA插入到pEGFP-N1载体上，构建pEGFP-N1与各基因型ICAM-1的表达载体。2稳定转染细胞系的建立将构建好的各基因型质粒以脂质体（Effectene Transfection Reagent）介导转染CHO细胞并加G418筛选培养，最终建立稳定转染单克隆细胞系。用流式细胞仪（BD FACSCaliburTM）检测每种基因型在挑取克隆中的表达，结果以平均荧光强度（MFI）和绿色荧光阳性细胞百分率（%Gate）表示。3黏附试验将稳定表达的各基因型ICAM-1-GFP-CHO稳定接种于48孔板，分组实验：①Control（对照组）；②ICAM-1-GK-GFP-CHO；③ICAM-1-GE-GFP-CHO；④ICAM-1-RK-GFP-CHO；⑤ICAM-1-RE-GFP-CHO。采集健康志愿者静脉血，用淋巴细胞分离液离心分离得到人PBMCs，并用荧光标记的麦胚凝集素（WGA）染色。将PBMCs加入各组实验细胞，37℃放置30分钟后PBS洗去未黏附的PBMCs，荧光显微镜下观察被黏附细胞个数。4AFM测定ICAM-1与Mac-1的单分子力谱按照标准程序清洁AFM探针，随后完成其羟基化、硅烷化和巯基修饰，聚乙二醇作为连接探针针尖和连接蛋白的中间物，其两端的活性基团——NHS和MAL分别连接人重组Mac-1纯化蛋白-NH2-和针尖上的-SH从而使Mac-1共价结合在探针针尖上。将4种基因型的ICAM-1-GFP和对照组GFP质粒经脂质体介导分别转染CHO和COS-7细胞后分组测力。在原子力显微镜与荧光显微镜连用系统中，AFM针尖可通过荧光标记精确定位细胞表面ICAM-1表达区域，设定探针的加载速率为2×103-3.2×103pN/s，对表达目的基因的细胞表面区域反复进针和退针，从而获得各基因型ICAM-1与Mac-1之间的随机力-距离曲线，统计得出其亲和力的高斯分布及结合几率。结果：1经测序鉴定，获得正确野生型人ICAM-1（ICAM-1-GK） DNA序列，并成功突变其氨基酸241与469位点，得到ICAM-1-GE、ICAM-1-RK和ICAM-1-RE。2双酶切鉴定显示成功构建ICAM-1-GK-GFP、 ICAM-1-GE-GFP、ICAM-1-RK-GFP、ICAM-1-RE-GFP质粒，激光共聚焦显微镜观察4种经上述质粒转染的CHO细胞，显示目的蛋白定位于细胞膜上。3获得稳定表达ICAM-1-GK-GFP、 ICAM-1-GE-GFP、 ICAM-1-RK-GFP、ICAM-1-RE-GFP和对照组GFP的CHO细胞系，流式细胞术测定平均荧光强度（MFI）和绿色荧光阳性细胞百分率（%Gate）表明各基因型ICAM-1在挑取克隆中的表达无显著性差异。4上述各CHO细胞系与人PBMCs黏附实验显示，GK、GE、RK、RE黏附细胞数比对照组GFP显著增多（P<0.05），而GK、GE、RK、RE之间黏附细胞数无显著性差异（P>0.05）5原子力显微镜测得各组细胞单分子力谱结果表明，CHO细胞和COS-7细胞对ICAM-1与Mac-1的单分子力谱影响无显著性差异（P>0.05）；ICAM-1的GK、GE、RK、RE基因型之间与Mac-1的单分子力谱无显著性差异（P>0.05）；ICAM-1的上述4种基因型与转染CHO/COS-7细胞这两种处理因素之间无交互作用（P>0.05）；AFM对各组细胞与Mac-1结合几率测定结果表明，ICAM-1的4种基因型比对照组GFP显著增加（P<0.05）；经CD11b抗体阻断后，GK、GE、RK、RE与Mac-1的结合几率显著减小（P<0.05），而GFP与Mac-1的结合几率无显著差异（P>0.05）。结论：1ICAM-1与GFP融合表达载体不影响ICAM-1在细胞膜上的定位与表达。2人ICAM-1氨基酸位点G241R和K469E的单核苷酸多态性不影响其与Mac-1的单分子力谱大小。3CHO细胞系和COS-7细胞系均可作为转染细胞系研究ICAM-1的单分子力谱。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 白细胞和内皮细胞黏附分子在炎症性心脏病中的作用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历