苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究

论文摘要

苹果渣与棉粕产量巨大,但目前尚未对其进行充分的综合利用,这不仅是资源的浪费,也带来了环境污染问题。另一方面发酵工业普遍采用的常规原料,如淀粉、葡萄糖、蔗糖等碳源,豆粕、麸皮、蛋白胨等氮源,近年来缺口很大,价格飞升,导致发酵产品成本上升,很多附加值较低的产品出现亏损。因此,本文拟将碳水化合物含量丰富的苹果渣与蛋白质含量丰富的棉粕用作碳源与氮源,部分取代常规发酵原料,生产NSP酶,以降低生产成本,部分解决发酵工业与人争粮、与畜争饲的问题,提升这些残渣资源的价值,同时也有利于环境保护。1、棉酚对微生物的影响及其生物脱毒以棉粕作为发酵原料,必须考虑棉酚对发酵过程的影响与产品中棉酚的残留问题。研究结果表明,棉酚对米曲霉F5、黑曲霉HG-1、黑曲霉F1、黑曲霉F2、黑曲霉F3、米曲霉F4等真菌孢子的萌发具有一定的抑制作用。在孢子萌发的初期,抑制效应比较明显,在6h时,含棉酚10μg/mL的培养基中米曲霉F5孢子的萌发率仅为对照的36.4%,但随着时间的延长,这种抑制效应不再明显,这说明棉酚只能抑制孢子的萌发,但不能杀死孢子。棉酚对真菌菌丝的生长具有一定的影响,但未达到显著水平,棉酚含量为10μg/mL的培养基中菌丝生长没有受到明显的抑制。实验所采用的微生物对棉粕脱毒都有一定的效果,但不同菌种以及同一菌种的不同菌株之间棉酚脱毒能力相差很大,其中白地霉G07的脱毒能力最强。采用Plackett–Burman实验设计与响应面实验设计对白地霉G07固态发酵棉粕脱毒的工艺进行了优化,结果标明,最佳培养基组成为1.63%（w/w）（NH4）2SO4,0.10%（w/w）KH2PO4,0.05%（w/w）MnSO4,0.1%（w/w）MgSO4,0.2%（w/w）CaCl2,初始含水量为62.19%（w/w）。在上述最佳培养基中,30°C培养48h,基质中自由棉酚的含量由144.0μg/g下降至30.42μg/g,这表明白地霉G07具有较高的棉酚脱毒能力。对干重减重与棉酚残留量的回归分析表明,在0～48h期间,棉酚脱毒率与菌体生长呈高度线性相关。体外消化实验表明,生物脱毒样品中的结合棉酚比FeSO4脱毒样品中的结合棉酚在体外消化过程中更稳定,也就是生物脱毒样品比FeSO4脱毒样品的安全性要高。生物脱毒后棉粕的营养价值得到了提高,粗蛋白与精蛋白含量提高显著,分别达12.6%与19.7%;氨基酸总量与必需氨基酸含量也大幅度提高,分别达17.0%与36.4%,蛋氨酸、赖氨酸与苏氨酸含量分别提高46.9%,21.0%与59.3%。2、黑曲霉HG-1固态发酵生产果胶酶苹果渣中果胶含量高,可诱导微生物分泌大量的果胶酶,是生产果胶酶的良好原料。本文选用果胶酶产量较高的黑曲霉HG-1为生产菌种,采用单因子实验和正交实验对其固态发酵工艺进行优化,结果表明,最适产酶培养基为苹果渣10g、棉粕10g、（NH4）2SO40.2g、K2HPO4 0.06g、初始水分含量60%;最佳装料量为每瓶20g干料,30℃恒温培养48h,果胶酶酶活力可达22248 U/g。同时,对所产果胶酶的酶学性质进行了初步研究,结果表明,该酶酶促反应最适温度为45℃,最适pH为5.0;在50℃以下,pH 3.0～6.0时稳定性良好;Ca2+、Mg2+、Fe2+对该酶有激活作用,而Ba2+、Mn2+、Zn2+有抑制作用。3、黑曲霉F1与F3固态混菌发酵生产果胶酶、蛋白酶与纤维素酶与单一菌种发酵相比,混菌发酵具有更多的优势,多菌种在基质利用能力上互相补充,可以在价格低廉、营养组成复杂的基质上良好生长。本文所采用的两株黑曲霉具有不同的酶系,黑曲霉F1虽然对纤维素类物质的具有很强的分解能力,但在以棉粕为氮源的发酵体系中,相对较弱的蛋白质分解能力成为其生长的限制性因素;与此相反,黑曲霉F3虽然对蛋白质的分解能力很强,但在以苹果渣为碳源的发酵体系中,相对较弱的纤维素类物质的分解能力成为其生长的限制性因素;二者进行混菌发酵时,酶系作用互补,双方均可得到更好的生长,发酵产物的酶系组成更为合理,既有纤维素类物质的水解酶类,也含有蛋白质的水解酶类,同时,酶活水平更高。研究结果表明,混菌发酵的最佳培养基组成为苹果渣与棉粕1:1（w/w）,（NH4）2SO41%（w/w）,KH2PO4 0.1%（w/w）,黑曲霉F1与F3最佳配比为2:1（w/w）,接种量0.4%（w/w）,30℃恒温培养48h;果胶酶、蛋白酶、和纤维素酶活力分别达到21168 U/g,3585 U/g和1208U/g。除蛋白质含量较低外,苹果渣中果胶、单宁等抗营养因子含量较高也是制约其饲用价值的限制性因素。在发酵过程中,果胶与单宁等抗营养因子的降解率分别为99.0%和66.1%,可消除其抗营养作用。另外,发酵过程中低分子糖类被利用,蛋白质与氨基酸含量显著提高,营养价值得到全面的改善。4、黑曲霉SL-05固态发酵生产木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶除果胶酶、纤维素酶外,β-甘露聚糖酶与木聚糖酶等其他NSP酶也可以采用苹果渣为主要原料进行生产。本文以苹果渣为碳源,通过单因素实验和统计学实验设计,采用回归分析研究了黑曲霉SL-05固态发酵产β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶的工艺条件,确定了菌株SL-05发酵产酶的最佳培养基:棉粕和苹果渣比例1:1（w/w）、尿素2%（w/w）、葡萄糖2%（w/w）、KH2PO4 0.12%（w/w,β-甘露聚糖酶）、0.06%（w/w,木聚糖酶）、0.09%（w/w,纤维素酶）,含水率60%（w/w,β-甘露聚糖酶）、65%（w/w,木聚糖酶）、62%（w/w,纤维素酶）。最佳的培养时间为48 h,此时未见孢子生成,酶活值已经达到了较高水平。在最佳条件下,β-甘露聚糖酶、木聚糖酶与纤维素酶的酶活力分别为296 U/g（干曲）、6347 U/g（干曲）与66032 U/g（干曲）,比优化前分别提高了61%、49%、53%。发酵后大部分氨基酸含量增加,特别是几种常见限制性氨基酸,赖氨酸、蛋氨酸与组氨酸分别提高了38%、85%、69%。对β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶酶学性质的初步研究表明,三种酶均为酸性酶,最佳反应pH分别为5.0、5.0、4.5,在pH 3.5～6.0范围内处理6 h和1 h残余酶活均保持在85%以上;三个酶的最适反应温度分别是80℃、55℃、75℃,β-甘露聚糖酶和纤维素酶热稳定性较好,β-甘露聚糖酶50℃处理6 h、纤维素酶60℃处理60 min后剩余酶活都保持在80%以上,而木聚糖酶60℃处理60 min后残余酶活只剩下17.35%。β-甘露聚糖酶酶促反应的Km和Vmax分别是0.83 g/L、166.67μmol/min。实验还研究了金属离子对β-甘露聚糖酶的影响,结果表明,Fe2+与Mg2+对酶活有激活作用,其中Fe2+的激活作用最为显著,可达127%;Cu2+对β-甘露聚糖酶的酶活有明显的抑制作用（91%）;Ca2+在浓度为0.5 mmol/L时对甘露糖酶具有激活作用,但在浓度为1.0 mmol/L时表现为抑制作用。以上研究表明:以苹果渣与棉粕代替麸皮、豆粕、淀粉等常规原料作为果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶等NSP酶的生产原料在技术上具有可行性,在产生多种水解酶类、提高蛋白质含量的同时,还可降解果胶、单宁等抗营养因子,改善饲料的饲用价值。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1 苹果渣的研究现状与进展

1.1 苹果渣的营养价值

1.2 苹果渣的抗营养因子

1.3 苹果渣的综合利用

1.3.1 生产生物饲料

1.3.2 提取果胶

1.3.3 生产膳食纤维

1.3.4 生产食用菌

1.3.5 生产酒精与果酒

1.3.6 生产有机酸

1.3.7 生产酶制剂

1.3.8 其他用途

2 棉粕的研究现状与进展

2.1 棉粕的营养价值

2.2 棉粕的抗营养因子

2.3 棉粕脱毒方法

2.3.1 物理脱毒法

2.3.2 化学脱毒法

2.3.3 生物脱毒法

3 NSP 酶的研究现状与进展

3.1 果胶酶

3.1.1 果胶酶的组成与作用机理

3.1.2 果胶酶的生产

3.1.3 果胶酶的应用

3.2 木聚糖酶

3.2.1 木聚糖酶的组成

3.2.2 木聚糖酶的作用机理

3.2.3 木聚糖酶的生产

3.2.4 木聚糖酶的应用

3.3 纤维素酶

3.3.1 纤维素酶的组成

3.3.2 纤维素酶的作用机理

3.3.3 纤维素酶的生产

3.3.4 纤维素酶的应用

3.4 β-甘露聚糖酶

3.4.1 β-甘露聚糖酶的组成

3.4.2 β-甘露聚糖酶的生产

3.4.3 β-甘露聚糖酶的应用

4 本研究的目的与内容

4.1 研究目的与意义

4.2 研究内容

4.2.1 棉酚对发酵过程的影响及棉粕生物脱毒

4.2.2 黑曲霉HG-1 固态发酵生产果胶酶

4.2.3 黑曲霉F1 与F3 混菌发酵生产果胶酶、纤维素酶与蛋白酶

4.2.4 黑曲霉SL-05 固态发酵生产木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶

4.3 主要技术路线

4.4 本研究的特点与创新之处

第二章棉酚对发酵过程的影响及棉粕生物脱毒

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

1.1.2 原料

1.1.3 试剂

1.1.4 基础培养基

1.2 菌种制备方法

1.3 分析方法

1.3.1 棉酚的测定

1.3.2 粗蛋白、精蛋白与氨基酸的测定

1.3.3 其他指标的测定

1.4 实验设计

1.4.1 灭菌过程的脱毒效应

1.4.2 棉酚对真菌孢子萌发的影响

1.4.3 棉酚含量对真菌菌丝生长的影响

1.4.4 棉酚对黑曲霉产酶能力的影响

1.4.5 棉酚高效脱毒菌株的选择

1.4.6 碳源种类的选择及其最佳添加量的确定

1.4.7 Plackett–Burman 实验设计

1.4.8 二次正交旋转组合实验设计

1.4.9 接种量、培养温度与培养基初始pH 值的优化

1.4.10 细胞生长与棉酚脱毒的时间曲线

1.4.11 体外消化实验

2 结果与分析

2.1 灭菌对棉粕的脱毒效应

2.2 棉酚含量对孢子萌发的影响

2.3 棉酚含量对菌丝生长的影响

2.4 棉酚对黑曲霉产酶能力的影响

2.5 棉粕高效脱毒菌株的选择

2.6 不同碳源对棉粕脱毒率的影响

2.7 苹果渣添加量对脱毒率的影响

2.8 Plackett–Burman 实验结果

2.9 二次回归正交旋转组合实验结果

2.10 接种量、培养温度与培养基初始 pH 值对脱毒率的影响

2.11 发酵时间对细胞生长与棉酚脱毒率的影响

2.12 体外消化过程中的自由棉酚的再释放

2.13 生物脱毒对蛋白质与氨基酸含量的影响

3 讨论

4 本章小结

第三章黑曲霉HG-1 固态发酵生产果胶酶

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

1.1.2 原料与试剂

1.1.3 培养基

1.2 方法

1.2.1 苹果渣和棉粕配比对产酶的影响

1.2.2 无机氮源对产酶的影响

1.2.3 正交实验设计

1.2.4 培养温度对产果胶酶的影响

1.2.5 装料量对产果胶酶的影响

1.2.6 果胶酶酶活力测定

1.2.7 果胶酶的部分酶学性质

2 结果与分析

2.1 苹果渣和棉粕配比对产酶的影响

2.2 无机氮源对产酶的影响

2.3 正交实验结果

2.4 培养温度对产酶的影响

2.5 装料量对产酶的影响

2.6 发酵时间对黑曲霉HG-1 生长与产果胶酶的影响

2.7 果胶酶的最适作用温度与 pH 值

2.8 果胶酶的热稳定性

2.9 果胶酶的 pH 值稳定性

2.10 金属离子对果胶酶活力的影响

M）和最大反应速率(V_MAX)'>2.11 米氏常数（K_M）和最大反应速率(V_MAX)

3 讨论

4 本章小结

第四章黑曲霉F1 与F3 混菌发酵生产果胶酶、纤维素酶与蛋白酶

1 材料与方法

1.1 菌种

1.2 原料与试剂

1.3 培养方法

1.4 测定方法

2 结果与分析

2.1 菌种及其配比对产酶的影响

2.2 苹果渣与棉粕配比对产酶的影响

2.3 无机氮源对产酶的影响

2.4 正交实验结果

2.5 接种量、温度、pH 值等发酵条件对产酶的影响

2.6 发酵时间对菌体生长与酶活力的影响

2.7 抗营养因子的降解

2.8 发酵前后可溶性糖、蛋白质与氨基酸含量的变化

3 讨论

4 本章小结

第五章黑曲霉 SL-05 固态发酵生产木聚糖酶、纤维素酶与 β-甘露聚糖酶

1 材料与方法

1.1 菌种

1.2 原料与试剂

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力分析

1.3.2 蛋白质与氨基酸的测定

1.3.3 还原糖与总糖的测定

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验设计

1.4.2 Plackett-Burman（PB）实验设计

1.4.3 二次正交旋转实验设计

1.4.4 验证实验

1.4.5 温度与pH 值对酶活的影响

1.4.6 酶的pH 值稳定性与热稳定性

1.4.7 β-甘露聚糖酶酶促反应动力学曲线

1.4.8 金属离子对β-甘露聚糖酶的影响

2 结果与分析

2.1 氮源对产酶的影响

2.2 苹果渣和棉粕配比对 β-甘露聚糖酶的影响

2.3 附加C 源及其含量对产酶的影响

2.4 无机N 源及含量对产酶的影响

2.5 Plackett-Burman 实验结果

2.5.1 木聚糖酶

2.5.2 β-甘露聚糖酶与纤维素酶

2.6 二次回归的正交旋转组合实验结果

2.6.1 木聚糖酶

2.6.2 β-甘露聚糖酶与纤维素酶

2.7 验证实验

2.7.1 木聚糖酶

2.7.2 β-甘露聚糖酶与纤维素酶

2.8 酶活随培养时间的变化关系

2.9 发酵过程中各指标随培养时间的变化关系

2.10 发酵前后氨基酸成分的变化

2.11 木聚糖酶、纤维素酶与 β-甘露聚糖酶的酶学性质

2.11.1 温度对木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶酶活力的影响

2.11.2 pH 值对木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶酶活力的影响

2.11.3 木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶酶活力的热稳定性

2.11.4 木聚糖酶、纤维素酶与β-甘露聚糖酶的pH 稳定性

2.11.5 β-甘露聚糖酶的动力学曲线

2.11.6 金属离子对β-甘露聚糖酶活的影响

3 讨论

4 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

苹果渣与棉粕固态发酵生产NSP酶的研究

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