Hg2+对木瓜蛋白酶催化性能及其作用机理的研究

论文摘要

木瓜蛋白酶（papain）是一种具有蛋白酶和酯酶活性的巯基蛋白酶。在食品、医药、纺织、日化等生产中广泛应用。通过探讨温度、pH、底物浓度、酶浓度和时间对木瓜蛋白酶水解活性的影响,其最优酶解条件为：温度4℃,pH 7.0,底物浓度2.0 mg/mL,酶浓度为1.0mg/mL,酶解30 min。研究10-2～10-9mol/L浓度范围的Hg2+对木瓜蛋白酶酶活的影响。当Hg2+浓度≥10-5mol/L时,Hg2+抑制其酶活,且高于10-3mol/L时,Hg2+使木瓜蛋白酶失活。当Hg2+浓度≤10-7mol/L时,Hg2+对该酶酶活几无影响。特别是当Hg2+浓度为10-6mol/L时,Hg2+可激活木瓜蛋白酶的活性,酶的Ea降低,水解反应速率提高,半寿期延长。荧光光谱、FTIR与CD的分析结果表明,Hg2+可与木瓜蛋白酶某些基团相互作用,影响其空间构象。木瓜蛋白酶的热失活为多步过程,10-6mol/L的Hg2+处理酶和纯酶热失活可分为三阶段,其中75～80℃为酶失活变性的跃迁点,样品酶急速失活,酶活力均下降50%左右。在同一温度下,木瓜蛋白酶可划分为热稳定性不同的两组分,且每个组分均符合一级失活动力学,其热失活反应为两步串联失活。其中,10-6mol/L Hg2+处理的木瓜蛋白酶的结构更为稳定,失活能Ea要高于纯酶,延缓其失活反应速率,导致该酶难以失活。通过正交实验,优化木瓜蛋白酶水解莲子蛋白工艺条件,在温度45℃,pH值7.0,酶添加量1.67g/L,底物浓度3.0%条件下反应40 min,其水解度为9.497%,蛋白降解率为69.43%。实验表明,10-6mol/L的Hg2+可以提高木瓜蛋白酶的水解莲子蛋白的催化能力,在实际应用中,Hg2+对木瓜蛋白酶酶解莲子蛋白与酶解酪蛋白所得结果一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 木瓜蛋白酶
• 1.2.1 木瓜蛋白酶的结构及其性质
• 1.2.2 木瓜蛋白酶催化作用机理
• 1.2.3 木瓜蛋白酶的应用
• 1.3 金属离子与酶
• 1.3.1 金属离子对酶的作用
• 1.3.2 酶、金属与底物的作用
• 2+与酶'>1.3.3 Hg²⁺与酶
• 1.4 莲子蛋白多肽
• 1.4.1 莲子蛋白多肽
• 1.4.2 水解度计算
• 1.5 本课题研究的内容和意义
• 第2章 木瓜蛋白酶水解参数优化
• 2.1 实验仪器与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.3 测定方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酪氨酸溶液标准曲线
• 2.4.2 最适酶解时间
• 2.4.3 最适酶解温度
• 2.4.4 最适酶解pH
• 2.4.5 最适底物浓度
• 2.4.6 最适酶浓度
• 2.5 结论
• 2+与木瓜蛋白酶活性及构象'>第3章 Hg²⁺与木瓜蛋白酶活性及构象
• 3.1 实验仪器与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 测定方法
• 3.3.1 紫外光谱
• 3.3.2 荧光光谱
• 3.3.3 傅里叶红外图谱（FTIR）
• 3.3.4 圆二色光谱（CD）
• 3.4 结果与讨论
• 2+浓度对酶活的影响'>3.4.1 Hg²⁺浓度对酶活的影响
• 3.4.2 木瓜蛋白酶FTIR光谱结构分析
• 3.4.3 木瓜蛋白酶的圆二色图谱分析
• 3.4.4 木瓜蛋白酶荧光光谱结构分析
• 3.5 结论
• 2+处理下木瓜蛋白酶水解反应动力学'>第4章 Hg²⁺处理下木瓜蛋白酶水解反应动力学
• 4.1 实验仪器与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.3 测定方法
• 4.3.1 木瓜蛋白酶不可逆反应动力学
• 4.3.2 木瓜蛋白酶酶热稳定性的测定
• 4.3.3 木瓜蛋白酶热处理
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 时间和初始反应底物（酪蛋白）浓度
• m值'>4.4.2 木瓜蛋白酶的K_m值
• 2+作用下底物保护作用'>4.4.3 Hg²⁺作用下底物保护作用
• a'>4.4.4 木瓜蛋白酶表观活化能E_a
• 4.4.5 木瓜蛋白酶酶促反应速度
• 2+对木瓜蛋白酶稳定性的影响'>4.4.6 Hg²⁺对木瓜蛋白酶稳定性的影响
• 4.4.7 纯酶的热失活曲线
• 4.4.8 木瓜蛋白酶的热失活速率的测定
• 2+对木瓜蛋白酶的表观失活活化能的影响'>4.4.9 Hg²⁺对木瓜蛋白酶的表观失活活化能的影响
• 4.5 结论
• 第5章 木瓜蛋白酶催化水解反应的应用
• 5.1 实验仪器与试剂
• 5.2 实验方法
• 5.3 测定方法
• 5.3.1 莲子蛋白的提取
• 5.3.2 莲子蛋白水解
• 5.3.3 水解度的测定
• 5.3.4 降解率的测定
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 最适宜水解时间
• 5.4.2 酶添加量对蛋白质水解的影响
• 5.4.3 温度对蛋白质水解的影响
• 5.4.4 底物浓度对蛋白质水解的影响
• 5.4.5 pH值对蛋白质水解的影响
• 5.4.6 蛋白质水解的正交实验
• 2+对蛋白质水解的影响'>5.4.7 Hg²⁺对蛋白质水解的影响
• 5.5 结论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新之处
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间取得的主要成果