2，3’, 4, 5’-四甲氧基二苯乙烯对子宫内膜癌细胞的作用

论文摘要

目的：子宫内膜癌（endometrial cancer,EC）为起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤,也是女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，约占女性总癌症的7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%30%，近年来发病率和死亡率均有逐渐上升的趋势,严重危害女性健康。作为一种性激素依赖性肿瘤，长期持续的无孕激素拮抗的内源性或外源性雌激素刺激是目前比较认同的病因之一。传统的治疗手段主要是手术治疗，辅以放疗、化疗、激素治疗，然而在肿瘤化疗的过程中，抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常增殖细胞也有杀伤作用，因而影响化疗的效果。所以如何使药物对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞毒性减少到最低的化疗方案成为人们关注的焦点之一。近年来，肿瘤的分子靶向治疗越来越受到研究者的重视，也为开创子宫内膜癌的新的治疗方法指明了方向。细胞色素P4501B1（cytochromeP4501B1,CYP1B1）是一种在许多与激素相关的肿瘤组织中特异性高表达的酶，可代谢雌激素成为致癌产物，激活芳香烃类前致癌物。已有研究发现，CYP1B1在子宫内膜癌组织中高表达，而在相应的正常组织中低表达,表明CYP1B1在子宫内膜癌的发生及发展的过程中很可能起重要的作用。2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯（2,3′,4,5′-tetramethoxystilbene，TMS）是目前所发现的专一性最高的CYP1B1抑制剂之一,它可以特异性抑制CYP1B1介导的雌二醇4位羟化。本研究以子宫内膜癌细胞Ishikawa为研究对象，探讨TMS对细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨其内在作用机制，为子宫内膜癌的靶向性治疗提供新的思路。方法：1细胞培育：常规复苏冻存的Ishikawa细胞接种于100ml培养瓶中,在含10%胎牛血清，100U/ml的青霉素及链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。以0.25%胰蛋白酶消化传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。2应用免疫细胞化学检测子宫内膜癌细胞Ishikawa中CYP1B1蛋白的表达情况：采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（Streptavidin/Peroxidase,SP）法。3应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测TMS对Ishikawa细胞的增殖程度的影响，绘制细胞生长抑制率曲线,并在倒置显微镜下观察用药前后细胞形态学改变。4应用流式细胞仪检测TMS对Ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响：将浓度为2.5×105个/ml的细胞悬液接种于100ml培养瓶中，待贴壁后，实验组加入不同浓度（10、20、40、80μmol/L）的TMS培养液，对照组加入等量的培养液。继续培养48h，用胰酶消化后收集细胞，70%的冷乙醇固定，PI（50μg/ml）0.5ml避光染色后,置流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司生产）分析。5应用流式细胞仪检测TMS对Ishikawa细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Survivin表达水平的影响：同上述收集不同浓度（0、10、20、40、80μmol/L）TMS作用48h后的Ishikawa细胞，70%的冷乙醇固定后，分别加入Bcl-2、Bax及Survivin抗体（各抗体均按1:50稀释）孵育，再加入相应的FITC-IgG二抗（1:50稀释）孵育后，置流式细胞仪分析。6运用统计软件SPSS13.0对所有数据进行统计学分析：所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验结果以x±s表示，多组比较时，方差齐者，采用单因素的方差分析，组间多重比较用SNK法；方差不齐者，采用非参数检验，组间多重比较用Kruskal-WallisH法。P<0.05表示有显著性差异。结果：1人子宫内膜癌细胞Ishikawa中CYP1B1蛋白为阳性表达，细胞浆或胞核中可见棕黄色颗粒，表明Ishikawa细胞中存在CYP1B1蛋白。2不同浓度（10、20、40、80μmol/L）的TMS分别作用于子宫内膜癌细胞Ishikawa24h、48h、72h后,细胞增殖受到明显抑制,各浓度间抑制率差异显著（P<0.05），且呈时间和浓度依赖性。3倒置显微镜下观察TMS作用后Ishikawa细胞的形态学变化：对照组的Ishikawa细胞生长状态良好，细胞伸展,呈细长多边形、梭形,呈对数生长，随时间推移，细胞逐渐增多,细胞接触紧密。当不同浓度（10、20、40、80μmol/L）的TMS作用Ishikawa细胞48h时,可见细胞皱缩变形,由梭形、多边形变成圆形,崩解坏死,细胞脱壁悬浮，细胞浆内出现空泡,细胞间隙变大。并出现细胞质浓缩,变圆,细胞核浓缩、核碎裂等细胞凋亡特征性形态学改变,但未见大量凋亡小体,凋亡细胞随着TMS浓度的增加而增加，贴壁细胞密度随着TMS浓度的增加而降低。4TMS对Ishikawa细胞凋亡和细胞周期的影响:经FCM检测发现，不同浓度（0、10、20、40、80μmol/L）TMS作用48h后，Ishikawa细胞凋亡率和细胞周期发生改变。细胞的凋亡率分别为（2.34±0.69）%，（6.09±0.91）%，（12.00±0.90）%，（16.63±0.55）%，（26.04±1.02）%，均高于对照组（P<0.05）,可见TMS促进Ishikawa细胞凋亡，细胞凋亡百分比随浓度的增加而增长。细胞周期中G0/G1期比例降低， G2/M期比例增高,并随TMS浓度的增加而增加,呈剂量依赖性,差异有显著性意义（P<0.05）,可见细胞被阻滞于G2/M期。5TMS对Ishikawa细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Survivin表达的影响：经FCM检测发现，不同浓度（0、10、20、40、80μmol/L）TMS作用48h后，Bcl-2和Survivin的表达水平明显下降，Bax的表达水平明显升高，呈剂量依赖性，不同浓度组间差异均有显著性差异（P<0.05）。结论：1CYP1B1蛋白在人子宫内膜癌细胞Ishikawa中有阳性表达，表明TMS对细胞的作用主要通过CYP1B1而作用。2TMS对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外生长具有明显的抑制作用，具有浓度和时间依赖性。一定浓度的TMS作用一定时间,出现细胞质浓缩,变圆,细胞核固缩、核碎裂等细胞凋亡特征性形态学改变,但未见大量凋亡小体。3TMS能诱导体外人子宫内膜癌细胞Ishikawa凋亡，并将细胞阻滞在G2/M期。凋亡率随着TMS浓度的增加而增长，其机制可能是通过下调凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin，上调促凋亡蛋白Bax而实现的。4TMS有可能成为子宫内膜癌靶向治疗的新型药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 细胞色素 P4501B1 及其抑制剂在肿瘤治疗中的应用进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历