番鸭呼肠孤病毒σC编码基因重组腺病毒载体的构建与组装

论文摘要

番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）病是一种高发病率、高致死率的番鸭传染病。自暴发以来,已给番鸭业造成严重的经济损失,成为制约我国番鸭业健康发展的主要疫病之一。目前国内外有关MDRV疫苗的研究报导仅见于福建省农业科学院畜牧兽医研究所选育的番鸭呼肠孤病毒弱毒株,该弱毒活疫苗具有良好的保护率,在有效防制番鸭呼肠孤病毒病中发挥了重要作用。但弱毒苗往往存在着水平排毒、毒力返强等安全性问题。因此有必要研制更安全、有效的疫苗。本实验以此为目的,构建了番鸭呼肠孤病毒σC编码基因重组腺病毒载体,并在AD293细胞上组装了重组腺病毒,为今后研究σC编码基因重组腺病毒疫苗奠定技术基础。根据已知的番鸭呼肠孤病毒MW9710分离株σC编码基因的核苷酸序列设计一对PCR引物,从σC编码基因重组T载体质粒中扩增出目的片段,构建了两端分别添加有Kpn I和Not I位点的σC编码基因片段。将Kpn I、Not I双酶切处理后的目的基因片段和pShuttle-CMV穿梭载体经过粘性末端连接,构建了含有σC编码基因的pShuttle-CMV-σC重组载体。pShuttle-CMV-σC阳性质粒经Pine I线性化后,电转化BJ5183感受态细胞,与pAdEasy-1骨架载体同源重组,构建成pAdCMV-σC重组腺病毒载体。pAdCMV-σC重组腺病毒载体经Pac I线性化后转染AD293细胞。转染后的AD293细胞于第7天产生病变,表明已在AD293细胞上组装了重组腺病毒。重组病毒经连续传代、PCR鉴定验证,表明σC编码基因能稳定地存在于重组腺病毒基因组中。有限稀释法测定结果表明重组病毒TCID50为109TCID50/ml。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 番鸭呼肠孤病毒研究进展
• 1.1.1 番鸭呼肠孤病毒病简介
• 1.1.2 病原学研究
• 1.1.3 病毒特性
• 1.1.4 分子生物学特征
• 1.1.4.1 病毒基因组
• 1.1.4.2 病毒蛋白及其功能研究
• 1.1.5 病理变化
• 1.1.6 分类地位
• 1.1.7 诊断与疫苗研究
• 1.2 腺病毒载体研究状况
• 1.2.1 腺病毒简介
• 1.2.2 腺病毒的基因组结构
• 1.2.3 病毒的感染周期
• 1.2.4 腺病毒载体的优点
• 1.2.5 腺病毒载体的构建策略
• 1.2.5.1 腺病毒载体系统简介
• 1.2.5.2 细胞内质粒同源重组法
• 1.2.5.3 大肠杆菌内质粒同源重组法
• 1.2.5.4 第三代腺病毒载体
• 1.2.6 基因工程疫苗与腺病毒载体的应用
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 载体、菌株及细胞系
• 2.1.2.1 载体及菌株
• 2.1.2.2 细胞系
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 常用试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 腺病毒载体系统完整性的验证
• 2.2.1.1 穿梭载体pShuttle-CMV的验证
• 2.2.1.2 骨架载体pAdEasy-1的验证
• 2.2.2 目的基因的制备
• 2.2.2.1 引物的设计
• 2.2.2.2 目的片段的扩增
• 2.2.2.3 目的片段Kpn I酶切位点的引入
• 2.2.3 重组载体pShuttle-CMV-σC的构建
• 2.2.3.1 目的片段和穿梭载体的双酶切及回收
• 2.2.3.2 重组载体pShuttle-CMV-σC的构建
• 2.2.3.3 重组克隆株pShuttle-CMV-σC的鉴定
• 2.2.4 同源重组腺病毒载体pAdCMV-σC的构建
• 2.2.4.1 BJ5183（pAdEasy-1）电转化感受态细胞的制备
• 2.2.4.2 重组载体pShuttle-CMV-σC的线性化及去磷酸化
• 2.2.4.3 线性化的重组载体pShuttle-CMV-σC电转化BJ5183（pAdEasy-1）感受态细胞
• 2.2.4.4 同源重组腺病毒载体pAdCMV-σC阳性克隆株的筛选与鉴定
• 2.2.4.5 阳性重组腺病毒载体pAdCMV-σC质粒的大量扩增
• 2.2.5 重组腺病毒载体pAdCMV-σC在AD293细胞上的组装
• 2.2.5.1 线性化pAdCMV-σC的制备
• 2.2.5.2 线性化重组腺病毒载体pAdCMV-σC转染AD293细胞
• 2.2.5.3 重组腺病毒vAdCMV-σC DNA水平上的鉴定
• 2.2.6 重组腺病毒vAdCMV-σC的扩增、滴度测定及遗传稳定性分析
• 2.2.6.1 重组腺病毒vAdCMV-σC的扩增
• 2.2.6.2 重组腺病毒vAdCMV-σC滴度测定
• 2.2.6.3 重组腺病毒vAdCMV-σC遗传稳定性分析
• 2.2.7 重组腺病毒vAdCMV-σC转录产物mRNA的分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 腺病毒载体系统完整性的验证
• 3.1.1 穿梭载体pShuttle-CMV的验证
• 3.1.2 骨架载体pAdEasy-1的验证
• 3.2 重组载体pShuttle-CMV-σC的构建
• 3.2.1 目的基因的制备
• 3.2.2 重组载体pShuttle-CMV-σC的构建
• 3.3 重组腺病毒载体pAdCMV-σC的构建
• 3.4 重组腺病毒vAdCMV-σC的组装与鉴定
• 3.5 重组腺病毒vAdCMV-σC滴度测定及遗传稳定性分析
• 3.5.1 重组腺病毒vAdCMV-σC滴度测定
• 3.5.2 重组腺病毒vAdCMV-σC遗传稳定性分析
• 3.6 重组腺病毒vAdCMV-σC转录产物mRNA的分析
• 3.6.1 重组腺病毒vAdCMV-σC转录产物RT-PCR扩增结果
• 3.6.2 重组腺病毒vAdCMV-σC转录产物的分析
• 第4章 讨论
• 4.1 载体的选择
• 4.2 AdEasy XL腺病毒载体系统
• 4.3 重组病毒载体的构建与组装
• 4.4 重组病毒的滴度测定
• 4.5 重组病毒DNA和mRNA转录水平上的分析
• 结论
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历