论文摘要
目的:探讨谷氨酸信号通路在表皮中的作用机制。方法:1.原代培养并纯化黑素细胞（Melanocyte,MC）;倒置显微镜观察MC细胞形态;免疫荧光显微镜观察MC中离子型谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸受体1（NMDAR1）和N-甲基-D-天冬氨酸受体2A（NMDAR2A）的细胞内分布;共聚焦显微镜观察谷氨酸信号通路对MC胞内钙离子浓度的影响以及MC内β-tubulin的分布。2.原代培养并纯化角质形成细胞（Keratinocyte,KC）;倒置显微镜观察KC细胞形态;免疫荧光显微镜观察KC中NMDAR1和NMDAR2A的细胞内分布;共聚焦显微镜观察谷氨酸信号通路对KC胞内钙离子浓度的影响以及KC内β-tubulin的分布;流式细胞仪测定NMDA受体拮抗剂MK-801对KC凋亡的作用。3.建立MC和KC共培养体系;倒置显微镜观察二者共培养的形态;扫描电镜观察MK-801作用下二者相互作用的形态学改变;酶标仪测定由MC向KC转运的黑素颗粒OD475值。结果:1.倒置显微镜下MC呈树突样生长;免疫荧光显微镜下显示黑素细胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在细胞浆内,而NMDA2A在树突分叉处表达更多;100μM浓度的NMDA使黑素细胞瞬时钙离子浓度升高,100μM浓度MK-801使其瞬时钙离子浓度降低,MK-801事先作用于MC5min或1h阻断了NMDA受体后,NMDA均不能再次诱发瞬时钙离子浓度升高;共聚焦显微镜观察发现MK-801作用24小时后导致黑素细胞树突回缩,胞内β-tubulin重新分布聚集于核周。2.倒置显微镜下KC为铺路石样生长;免疫荧光显微镜下显示角质细胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在细胞浆内;100μM浓度的NMDA使角质细胞瞬时钙离子浓度升高;流式细胞仪显示100μM的MK-801孵育角质细胞48h后凋亡细胞比例较对照组无明显差异;共聚焦显微镜下发现MK-801作用24小时后导致角质细胞核周的β-tubulin密度增大。3.扫描电镜观察发现100μM MK-801作用于共培养体系48h后,MC树突数量无明显变化,KC之间相互连接的丝状伪足的数量、KC表面的丝状伪足数量以及MC-KC间的丝状伪足减少;通过酶标仪测定共培养48h后,使用100μM MK-801孵育组与正常共培养的未处理组相比较,KC中的黑素颗粒OD475值明显降低,提示从MC向KC转运的黑素小体数量减少。结论:1.MC内有NMDAR1及NMDAR2A的表达。2.谷氨酸信号通路可影响MC胞内钙离子浓度。3.谷氨酸信号通路通过作用于MC内β-tubulin而影响MC丝状伪足的数量,而后者是该通路影响MC和KC间黑素转运的结构基础。4.KC内有NMDAR1及NMDAR2A的表达。5.谷氨酸信号通路影响KC细胞形态及其胞内钙离子浓度,而该形态学改变与细胞凋亡无关;同时影响KC中β-tubulin分布。
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