萝卜春化过程中的生理生化变化及开花基因LFY的克隆

论文摘要

中国萝卜（Raphanus sativus L.var. longgpinnatus Bailey）是原产于中国的一种重要蔬菜,我国萝卜种植面积在120万ha左右,位居各种蔬菜种植面积的前三位。目前,限制萝卜周年生产和均衡供应的瓶颈问题是缺乏耐抽薹萝卜种质,这也是生产中经常出现先期抽薹而造成重大损失的根本原因。因此,探明萝卜耐抽薹机制,将分子育种技术与传统育种技术有机的结合起来,创新萝卜耐抽薹种质,对加速我国萝卜育种进程具有重要理论和实践意义。本试验研究了萝卜春化过程中生长点的生理生化变化、萝卜高效遗传转化体系的建立,并克隆了开花关键基因LFY。主要试验结果如下:（1）低温处理过程中,抽薹性差异较大的两个品种短叶十三和长春大型可溶性蛋白、游离氨基酸、可溶性糖含量变化趋势基本一致。可溶性蛋白、游离氨基酸含量总体表现为逐渐升高的趋势,而可溶性糖含量则呈下降趋势。耐抽薹的萝卜品种长春大型,其可溶性蛋白和可溶性糖含量明显低于短叶十三,游离氨基酸含量则相反。两品种赤霉素（GAs）、生长素（IAA）的含量在花芽分化开始时均有较明显的峰值,在处理后期又出现另一明显峰值。（2）通过对影响转化效果的诸因素的研究,初步筛选出适宜萝卜品种短叶十三真空渗入的遗传转化体系:真空渗入时间为104pa负压条件下连续处理10 min,菌液浓度OD600为0.81.2,渗入培养基为1/2MS无机+B5有机+6-BA 0.04 mg·L-1+AS 19.6 mg·L-1,在蕾期对花蕾进行真空渗入。（3）以萝卜品种短叶十三的花蕾为材料,通过RT-PCR的方法,克隆了开花关键基因LFY部分cDNA序列,和已公布的大白菜LFY基因具有93%以上的同源性,将此序列以相反方向先插入到分子量较小（2686 bp）的中间载体pUC19上,并在两片段之间插入小麦乙酞辅酶A的第20个内含子,再将连接好的三个片段酶切后插入到植物表达载体pROK2 35S启动子之后,从而构建了双元dsRNA抑制载体,并通过真空渗入遗传转化法转入到弱冬性萝卜短叶十三试材中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 植物花芽分化与抽薹研究进展
• 1.1 外界条件对花芽分化和抽薹的影响
• 1.1.1 光照
• 1.1.2 温度
• 1.1.3 矿质营养和水
• 1.2 植物花芽分化过程中的生理生化代谢特点
• 1.2.1 碳水化合物代谢
• 1.2.2 可溶性蛋白代谢
• 1.2.3 植物生长调节物质代谢
• 1.3 花芽分化分子遗传机制
• 2 植株原位真空渗入法遗传转化方法研究进展
• 2.1 发展概况
• 2.2 真空渗入遗传转化原理
• 2.2.1 转化原初组织位点
• 2.2.2 转化植物的遗传
• 2.3 真空渗入法的转化条件
• 2.3.1 植物的基因型和菌株
• 2.3.2 真空度
• 2.3.3 植物发育时期
• 2.3.4 菌液浓度与转化介质（IM）构成
• 3 RNA 干扰技术及其植物基因工程中的应用
• 3.1 RNAi 的分子机制
• 3.1.1 RNAi 的发现
• 3.1.2 RNA 干涉的特征
• 3.1.3 RNA 干涉的作用机理
• 3.2 RNA 沉默的生物学功能
• 3.3 RNAi 技术在植物基因工程中的应用
• 3.3.1 果实性状的控制
• 3.3.2 植物抗病性研究
• 3.3.3 在植物雄性不育及育性恢复研究中的应用
• 3.4 RNAi 存在的问题及前景预测
• 第一章 春化过程中萝卜幼苗生长点的生理生化变化
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验方法
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 测定方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 萝卜低温春化过程中可溶性蛋白含量的变化
• 1.2.2 萝卜低温春化过程中游离氨基酸含量的变化
• 1.2.3 萝卜低温春化过程中可溶性糖含量的变化
• 1.2.4 萝卜低温春化过程中 GAs 含量的变化
• 1.2.5 萝卜低温春化过程中 IAA 含量的变化
• 1.2.6 萝卜低温春化过程中 ZR 含量的变化
• 1.2.7 萝卜低温春化过程中 ABA 含量的变化
• 1.3 讨论
• 第二章 萝卜植株真空渗入高效遗传转化体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 萝卜植株真空渗入遗传转化体系适宜苗态的建成
• 2.3 影响萝卜植株真空渗入遗传转化因素处理试验
• 2.3.1 不同真空渗入时间对转化影响试验
• 2.3.2 不同菌液浓度对转化影响试验
• 2.3.3 植株不同组织器官对转化影响试验
• 2.3.4 不同渗入培养基对转化影响试验
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 不同真空渗入时间对转化效果的影响
• 2.4.2 不同菌液浓度对转化效果的影响
• 2.4.3 植株不同组织器官对转化效果的影响
• 2.4.4 不同渗入培养基对转化效果的影响
• 2.5 讨论
• 第三章 萝卜开花基因 LFY 的克隆、dsRNA-LFY 植物表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株及载体
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 RNA 的提取方法（Trizol）
• 3.2.2 LFY 基因的克隆
• 3.2.3 双链 RNA 抑制载体pROK2-dsLFY 的构建
• 3.2.4 重组植物表达载体向农杆菌种的转化
• 3.3 萝卜植株的遗传转化
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 萝卜 LFY 基因的克隆及反义和正义 LFY 基因的 PCR 扩增
• 3.4.2 双链 RNA 抑制载体的构建
• 3.5 讨论
• 3.5.1 RNAi 的导入方式及其对dsRNA 长度的要求
• 3.5.2 关于内含子片段的探讨
• 3.5.3 使用 RNA 干扰技术时应注意的问题
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文