草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究

论文摘要

草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus, GCRV） ,属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属,其基因组的特点是11条分段dsRNA的3′端不含poly（A）尾,且在5′和3′末端各含有特异的重复保守序列。GCRV的基因组编码12种蛋白,包含7种结构蛋白和5种非结构蛋白。其中VP6是一种结构蛋白,它由S8基因片段编码,在病毒的转录与复制及病毒核衣壳的形成中起重要作用。NS38是一种非结构蛋白,它由S9片段编码,在病毒早期形态发生阶段起重要作用。有研究表明VP6诱导中和抗体效价较高,NS38诱导的中和抗体效价次之,二者都能够诱导中和抗体的产生。本研究以草鱼呼肠孤病毒096（GCRV096）为研究对象,应用同源克隆获得GCRV096 vp6和ns38基因序列,并对其进行表达,同时对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行研究。vp6基因含有一个1236 bp的开放阅读框（ORF）,编码412个氨基酸,预测VP6蛋白分子量约为44 kDa,等电点为8.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将vp6基因克隆至原核表达载体pET-28a（+）,构建原核表达质粒pET-vp6,然后导入到大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-VP6蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-VP6蛋白血清的效价为1:32000。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 vp6基因的表达进行定量,进而分析VP6蛋白的免疫原性,实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明VP6蛋白具有较强的免疫原性。ns38基因含有1059 bp的ORF,编码352个氨基酸,预测NS38蛋白分子量约为37.7 kDa,等电点为7.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将ns38基因克隆到原核表达载体pET-28a（+）,构建原核表达质粒pET-ns38,再导入到大肠杆菌BL21（DE3）进行表达,进而纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-NS38蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-NS38蛋白血清的效价为1:38400。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 ns38基因的表达进行定量,进而分析NS38蛋白的免疫原性;实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明NS38蛋白具有较强的免疫原性,而且在感染GCRV病毒4 h时,实验组病毒的含量与对照组之比最小,表明此时NS38蛋白发挥免疫原作用较强。本论文研究了GCRV096 vp6和ns38基因和VP6和NS38蛋白特性,并对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行了研究,为草鱼出血病的防治等研究提供了理论依据并奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 草鱼出血病的研究进展
• 1.2 GCRV 的结构与特征
• 1.2.1 形态结构
• 1.2.2 理化特性
• 1.2.3 分子生物学特征
• 1.2.4 培养特性
• 1.2.5 GCRV 的组织嗜性和病理变化
• 1.2.6 GCRV 多肽的免疫原性研究
• 1.2.7 病毒的检测
• 1.3 草鱼出血病的防治方法
• 1.3.1 疫苗的研究
• 1.3.2 免疫增强剂的研究
• 1.3.3 环境对草鱼出血病的免疫防治研究
• 1.3.4 其他防治方法的研究
• 1.4 研究的技术路线
• 1.5 本文研究的目的意义
• 2 GCRV096 vp6 基因的克隆、表达及VP6 蛋白免疫原性研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 病毒株和细胞系
• 2.2.2 质粒载体和受体菌株
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 vp6 基因克隆的方法
• 2.3.2 vp6 基因原核表达的方法
• 2.3.3 重组蛋白VP6 多克隆抗体制备的方法
• 2.3.4 VP6 蛋白免疫原性研究的方法
• 2.4 结果
• 2.4.1 vp6 基因的克隆
• 2.4.2 vp6 基因的原核表达
• 2.4.3 重组蛋白VP6 多克隆抗体效价的测定
• 2.4.4 VP6 蛋白免疫原性研究
• 2.5 讨论
• 3 GCRV096 ns38 基因的克隆、表达及其NS38 免疫原性研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 病毒株和细胞系
• 3.2.2 质粒载体和受体菌株
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 ns38 基因克隆的方法
• 3.3.2 ns38 基因原核表达的方法
• 3.3.3 重组蛋白NS38 多克隆抗体制备的方法
• 3.3.4 NS38 蛋白免疫原性研究的方法
• 3.4 结果
• 3.4.1 ns38 基因的克隆
• 3.4.2 ns38 基因的原核表达
• 3.4.3 重组蛋白NS38 多克隆抗体效价的测定
• 3.4.4 NS38 蛋白免疫原性研究
• 3.5 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介