迷迭香酸抑制肾小管上皮-间充质转分化的作用及机制研究

论文摘要

肾间质纤维化（Renal Interstitial Fibrosis,RIF）已经成为多种肾脏疾病进展到终末期肾病（End-Stage Renal Disease,ESRD）的共同途径和主要病理学改变,可能较肾小球硬化在ESRD中起更重要的作用。病理状态下,肾小管上皮细胞可以发生上皮-间充质转分化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）,在肾间质纤维化过程中约36%的肌成纤维细胞是通过肾小管上皮细胞转分化而来的,因此,EMT在肾间质纤维化过程中扮演着重要的角色。转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）是最关键的促肾小管间质纤维化的生长因子之一,它能独立启动并完成EMT的全过程。TGF-β1诱导的EMT主要涉及Smad、PI3K、MAPK（ERK/P38/JNK）等信号通路,经进一步研究发现,活性氧簇（ReactiveOxygenSpecies,ROS）参与TGF-β1诱导的EMT信号通路,是MAPK信号通路的上游信号分子。TGF-β1可增加细胞内ROS的生成,促进Smad2、MAPK/P38、胞外信号调节激酶ERK1/2等磷酸化,从而促进EMT的发生。线粒体是ROS产生的主要场所,同时机体内存在抗氧化系统,生成与清除间平衡失调则使ROS积聚;ROS以线粒体为靶点,损伤其功能,加剧ROS生成,形成恶性循环。因此,线粒体功能与ROS关系密切。保护线粒体功能,抑制ROS生成可能成为抑制EMT进展的新的探索方向。迷迭香酸（Rosmarinic Acid,RA）是一种主要从迷迭香、紫苏等唇形科植物中提取的水溶性多酚类化合物单体,具有一系列重要的生物学功能,如抗病毒、抗细菌、抗炎和抗氧化等。研究小组前期研究显示,RA对大鼠系膜增生性肾小球肾炎（Mesangial Proliferative Glomerulonephritis,MsPGN）具有一定的治疗作用,其功能部分基于抗氧化作用,并初步发现RA通过其抗氧化作用可以延缓甚至逆转肾小管间质纤维化,抑制体外培养的肾小管上皮细胞EMT的发生。为进一步论证RA对EMT是否具有抑制作用及其发挥作用的机制,我们进行如下研究,分两部分进行。第一部分迷迭香酸对肾小管上皮-间充质转分化的抑制作用目的:应用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导小鼠肾小管上皮-间充质转分化（EMT）,研究迷迭香酸（RA）对EMT的影响。方法:体外培养小鼠近端肾小管上皮细胞（mouse proximaltu bular cells,mPTCs）,细胞同步化后给予RA干预,30min后加刺激剂TGF-β1。实验共分为4组:A.正常对照组;B.25μg/mlRA组;C.5ng/mlTGF-β1诱导组;D.5ng/mlTGF-β1+25μg/mlRA干预组。应用蛋白质免疫印迹（Western blot）,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）,荧光定量RT-PCR（real time quantitive RT-PCR）,从蛋白和核酸水平检测E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达情况。结果:正常对照组、RA组E-cadherin表达较高,Vimentin表达很低;TGF-β1刺激后E-cadherin表达下调,Vimentin表达明显上调。TGF-β1+RA干预组E-cadherin与Vimentin表达与正常组相比,无明显差别;RA干预可以部分抑制TGF-β1导致的E-cadherin及Vimentin的改变。结论:迷迭香酸能够部分抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。第二部分迷迭香酸对EEEMMT过程中线粒体功能的影响目的:探讨TGF-β1诱导的小鼠肾小管上皮细胞EMT过程中线粒体功能的改变,以及RA对线粒体功能的影响。方法:体外培养mPTCs,细胞同步化后给予干预和刺激。实验共分为4组:A.正常对照组;B.25μg/mlRA组;C.5ng/mlTGF-β1诱导组;D.5ng/mlTGFβ1+25μg/mlRA干预组。应用荧光定量RT-PCR技术检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数;生物发光法检测细胞ATP含量;采用JC-1、DCFDA（2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate,DCFDA）荧光染料预染肾小管上皮细胞,荧光显微镜及流式细胞仪检测线粒体膜电位（mitochondrialmembrane potential,ΔΨm）及ROS的变化;应用化学比色法测定琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH）活性;应用Western blot、荧光定量RT-PCR从蛋白及核酸水平检测线粒体锰超氧化物歧化酶（SOD2）及过氧化物酶体增殖物活化受体γ（Peroxisome proliferator-activedreceptorγ,PPARγ）共激活因子-1α（PPARγcoactivator1α,PGC-1α）表达情况。结果:（1）正常对照组与RA组相比较,各个检测指标均无统计学差异;2（）TGF-β1显著增加细胞内ROS水平,RA干预能够部分抑制TGF-β1诱导的ROS生成;（3）RA干预能够部分抑制TGF-β1诱导的mtDNA拷贝数的减少;（4）TGF-β1刺激组ATP水平显著降低,RA干预后再刺激则可使ATP水平升高;（5）RA能够部分恢复TGF-β1引起的SDH活性的减低;（6）RA能够部分恢复TGF-β1引起的线粒体膜电位的下降;（7）RA干预可部分下调TGF-β1诱导的SOD2及PGC-1α的升高。结论:TGF-β1诱导EMT的过程中存在线粒体功能障碍,RA可部分保护线粒体功能从而发挥抑制EMT的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 迷迭香酸对肾小管上皮- 间充质转分化的抑制作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 迷迭香酸对E MT 过程中线粒体功能的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 附录一 英文缩略词
• 附录二 就读期间科研工作小结
• 致谢