广西三黄鸡抗马立克氏病相关基因筛选的研究

论文摘要

马立克氏病（MD）是鸡的一种淋巴组织增生性疾病，对家禽业危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关基因筛选的研究，旨在确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作，以弥补传统的疫苗接种为主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下工作： 应用广西MDV-1强毒分离株YL040920／C6对7日龄46羽普通霞烟鸡（分两组：A组未免疫，24羽、B组1日龄免疫HVT，22羽）和53羽MD抗性鸡（分两组：C组未免疫，27羽、D组1日龄免疫HVT，26羽）分别进行攻毒试验，按常规分开隔离饲养，观察和记录鸡的死亡情况，至攻毒后（PC）12周结束试验。结果发现，A、B、C、D四组的肿瘤死亡率分别为66.67％、63.63％、44.44％和42.31％，肿瘤发生率分别为75.00％、72.72％、48.14％和46.15％，经t检验表明，MD抗性鸡的肿瘤死亡率显著低于普通霞烟鸡（P＜0.05），肿瘤发生率极显著低于普通霞烟鸡（P＜0.01）；免疫鸡与未免疫鸡之间的死亡率及肿瘤发生率差异不大（P＞0.05）；对不同脏器肿瘤发生率的统计表明，心脏肿瘤发生率最高（43.5％），肝脏肿瘤次之（29％），皮肤肿瘤再次之（10.6％）；采用血凝抑制（HI）试验测定试验鸡血清鸡新城疫（ND）和禽流感（AI）抗体的效价，结果表明经过多次ND和AI疫苗免疫后，鸡体ND和AI抗体滴度一直没能达到预期水平，表明MDV感染霞烟鸡后产生了一定的免疫抑制作用。攻毒前后共计五次无菌采集并分离鸡外周血淋巴白细胞（PBLs），置于—80℃保存，为下一步研究准备材料。 利用聚合酶链式反应（PCR）和限制性片段长度多态性（RFLP）分析的方法，对MDV攻毒后抗性存在差异的112份霞烟鸡PBLs生长激素基因第四内含子（GH1）的PCR扩增产物，采用限制性内切酶Sac Ⅰ和Msp Ⅰ分别进行限制性片段长度多态性检测。结果发现仅有1个Sac Ⅰ酶切位点存在于GH1上，不具备多态性，而在GH1上存在2个Msp Ⅰ酶切位点，形成6种基因型分别为：AA、AB、AC、BB、BC和CC。MD抗性鸡中AA型所占比例最高（50％），BB、CC型为（0％），在普通霞烟鸡中BB、CC型分别为（9.26％和1.85％）。经过卡方独立性检验表明，6种基因型在MD抗性鸡和普通霞烟鸡中的分布差异并不显著（P＜0.05）。MD抗性鸡基因纯合

论文目录

• 目录
• 前言
• 第一章 鸡抗马立克氏病遗传育种的研究进展
• 1 鸡抗MD遗传机制研究概况
• 1.1 抗感染
• 1.2 抗发病
• 2 鸡抗MD育种的研究进展
• 2.1 表型选择
• 2.2 DNA分子标记辅助育种
• 2.3 鸡抗MD的转基因育种
• 3 检测基因表达分析方法的比较
• 3.1 Northern印迹杂交
• 3.2 核糖核酸酶保护试验
• 3.3 实时定量PCR技术
• 4 鸡抗MD育种的前景展望
• 5 开展本课题的研究路线及其可行性分析
• 参考文献
• 第二章 MD抗性与普通霞烟鸡MDV攻毒试验
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 霞烟鸡攻毒试验
• 2.2 鸡PBLs的采集
• 2.3 霞烟鸡免疫应答血凝效价的结果
• 2.4 鸡PBLs及内脏器官组织的MDV、REV和ALV三重PCR检测
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 MD抗性与普通霞烟鸡生长激素基因PCR-RFLPs分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 数据统计方法
• 2 结果
• 2.1 Sac Ⅰ酶切
• 2.2 Msp Ⅰ酶切
• 2.3 GH1基因频率和基因型频率的分析
• 2.4 遗传特性分析
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 第四章 MD抗性与普通霞烟鸡B-F基因序列的测定与比较分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 B-Fala2基因的扩增
• 2.2 B-Fala2基因核甘酸序列的比较分析
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 第五章 定量测定MD抗性与普通霞烟鸡B-F基因mRNA核糖核酸酶保护法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 提取细胞内总RNA
• 2.2 B-Fα2α3基因的扩增
• 2.3 pMD 18-T-B-Fα2α3重组质粒的酶切、PCR和测序鉴定
• 2.4 pSP72-B-Fα2α3重组质粒的酶切鉴定
• 2.5 反义B-Fα2α3 RNA探针的鉴定
• 2.6 B-Fα2α3 RPA检测结果
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 结论
• 附表
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文