论文摘要
川楝素（toosendanin,TSN）是从传统驱蛔中药楝属植物川楝（Melia Toosendain Sieb. et Zucc）或苦楝（Melia azedarach L.）中分离得到的一种四环三萜类活性成分。川楝素除了临床应用的驱虫作用外,还具有阻遏乙酰胆碱释放、遏制前突触传递、易化L型Ca2+通道、抗肉毒作用和抑制肿瘤细胞增殖等多种生物效应。川楝素农用研究始于上世纪80年代,研究表明,川楝素对昆虫表现出多种生物活性,主要表现为拒食和胃毒作用。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心研制了0.5%楝素乳油,主要用于防治甘蓝上菜青虫和其它果蔬等经济作物上具有咀嚼式口器的害虫,均有较高的防治效果。对川楝素胃毒作用机理研究结果表明,川楝素对中肠消化酶无明显影响,可严重破坏中肠上皮细胞,推测川楝素可能作用于昆虫中肠的膜系统。随着对川楝素的进一步研究开发,亟需一种快速、灵敏的川楝素定量检测方法,以用于更深入的环境毒理及杀虫作用机理等方面的研究。本研究首先合成了川楝素人工抗原,建立了能分泌抗川楝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,制备了高特异性抗川楝素单克隆抗体;建立了适合于多种介质中痕量川楝素检测的间接竞争酶联免疫（IC-ELISA）分析方法;以粘虫为试虫,观察了川楝素处理对中肠上皮细胞超微结构的影响,并以川楝素单克隆抗体为一抗,胶体金标记的羊抗小鼠IgG为二抗,对川楝素处理后在粘虫中肠上皮细胞的结合进行了定位研究。研究主要结果如下:1.以川楝素和琥珀酸酐为原料,合成了川楝素半抗原,经高分辨质谱（HRMS）、红外光谱（IR）和核磁共振（1H-NMR,13C-NMR）分析,该化合物即为目标产物28-琥珀酸单酰川楝素（TSN-S）;利用混合酸酐法（MAR）和活泼酯法（EDC）将半抗原TSN-S偶联于载体蛋白牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上,红外扫描法证实获得偶联物同时具备半抗原和载体蛋白的吸收特征,表明人工抗原（TSN-S-BSA）和包被原（TSN-S-OVA）合成成功。2.以人工抗原TSN-S-BAS免疫5只BALB/C小鼠,经过3次免疫后,小鼠抗血清效价均大于100000。小鼠加强免疫后取5×107个脾脏细胞和1×107个SP2/0骨髓瘤细胞,0.7 mL 33%的聚乙二醇（PEG 4000,pH 8.0）为融和剂进行细胞融合。通过HAT选择型培养基筛选杂交瘤细胞,以TSN-S-OVA为包被原,采用间接ELISA方法进行阳性筛选,经过3次克隆化后,获得了能稳定分泌抗川楝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株EE7和FB9,两株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1:160和1:80。采用双向琼脂扩散法验证两株杂交瘤细胞培养上清均与抗IgG抗体有沉淀线,均为IgG类抗体蛋白,亚类均为IgG2b。3.将获得的两株杂交瘤细胞EE7和FB9扩大培养后,采用诱生腹水法制备了抗川楝素单克隆抗体腹水。腹水抗体EE7和FB9以辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,测得蛋白含量分别为4.25和3.32 mg/mL;采用方阵滴定法确定了包被原、腹水抗体、二抗的工作浓度分别为:包被原2000×,二抗5000×,EE7和FB9分别稀释6000×和4000×;采用间接ELISA方法测定抗体EE7和FB9效价分别为4×10-6和8×10-6。4.对IC-ELISA分析条件进行优化,确定了两个抗体最适pH、离子强度和有机溶剂。结果表明,对于抗体EE7的最适反应体系为:10%甲醇,pH 7.4,50 mmol/L PBS;对于FB9则为:10%甲醇,pH 7.4,100 mmol/L PBS。在优化的检测条件下,抗体EE7对川楝素的半数抑制浓度（IC50）为1.806 ng/mL,最低检测浓度为0.064 ng/mL,检测范围为0.22822.878 ng/mL;FB9对川楝素的半数抑制浓度（IC50）为3.803 ng/mL,最低检测浓度为0.632 ng/mL,检测范围为1.32237.530 ng/mL;IC-ELISA特异性检测表明,EE7和FB9对3种川楝素类似物均无明显的交叉反应。5.建立了0.5%楝素乳油、川楝树皮和川楝子提取物中川楝素的IC-ELISA分析方法。测定结果表明,0.5%楝素乳油中川楝素的含量为3.654 mg/mL;以甲醇为溶剂,采用超声波提取法测得川楝树皮和川楝子提取物中川楝素的含量分别为3.358%和0.232%,方法的添加回收率（Recovery）为95.5104.2%,相对标准偏差（RSD）均小于6.0%。该方法快速、简便、准确,可用于川楝素原药及其制剂生产上的质量控制。6.采用IC-ELISA方法分析了不同水体和土壤中的川楝素及川楝素的降解。当添加浓度为1和10μg/kg时,水中的添加回收率为82.3%98.2%,相对标准偏差（RSD）为2.6%9.2%;土壤中回收率在81.4%95.9%间,平均RSD为4.7%,表明建立的IC-ELISA方法适合于水体和土壤中痕量川楝素的检测。降解试验结果表明,川楝素属易降解或者极易降解农药。7.建立了川楝素在果蔬上残留IC-ELISA分析方法,分析了基质对ELISA检测的影响。3种空白果蔬样品中添加0200 ng/mL的川楝素,在优化的提取条件下,样品提取液稀释20倍进行IC-ELISA分析,在添加浓度为20200 ng/mL时,回收率为87.9%98.7%,批内、批间相对标准偏差均小于7.0%,符合药物残留分析要求。8.以粘虫6龄初幼虫为试虫,透射电镜下观察了川楝素饲喂处理对其中肠上皮细胞超微结构的影响。观察发现,川楝素可明显破坏中肠上皮细胞的膜结构,柱状细胞顶膜微绒毛肿胀、空泡化乃至消失,出现髓鞘样结构;光面内质网扩张和柱状细胞核异染质增多。随着川楝素作用时间的增加,对中肠细胞的破坏程度加深。9.粘虫中肠上皮细胞中川楝素的免疫电镜研究采用包埋后染色法进行。以1%OVA为封闭液,100×的川楝素单克隆抗体EE7为一抗、100×的15nm胶体金标记羊抗小鼠IgG为二抗,对置于镍网上的粘虫中肠组织超薄切片进行免疫染色,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后,在透射电镜下观察川楝素在中肠上皮细胞内的结合。观察发现,阴性对照无非特异性染色,未经川楝素处理的试虫中肠组织中未见金颗粒积聚;川楝素处理后0.5 h,川楝素主要结合在柱状细胞微绒毛上,处理24 h后可见大量的金颗粒积聚在肿胀的微绒毛和杯状细胞囊腔中微绒毛上,扩张的光面内质网及靠近微绒毛根部的细胞质上也有少量的金颗粒积聚。免疫定位结果表明川楝素在粘虫中肠组织中主要结合在的细胞质膜上,有较好的组织特异性,粘虫中肠细胞膜上可能存在川楝素的特异性受体。