抑菌肽产生菌的筛选及产物特性研究

论文摘要

乳酸菌能产生包括细菌素、有机酸、过氧化氢和双乙酰等在内的多种抗菌物质，在食品防腐上起到重要作用。本文采用牛津杯定量扩散法检测发酵上清液的抑菌活性，旨在筛选和鉴定高产广谱细菌素的菌株、优化发酵条件并测定所产细菌素的抑菌特性。从传统发酵制品中分离出56株乳酸菌，经过初筛共有27株能够抑制金黄色葡萄球菌AS1.72、大肠杆菌AS1.543和枯草芽孢杆菌AS1.308的生长。在排除有机酸及过氧化氢的干扰后，从中筛选出抑菌活性较高的菌株P-347，经常规生理生化实验及多糖发酵实验，鉴定菌株P-347为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。其发酵上清液经胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后抑菌活性丧失，证明发酵液中含有蛋白质性质的抑菌物质，即细菌素。测定菌株P-347发酵产细菌素的动态曲线得出，其在MRS培养基中于30℃培养24h时，发酵上清液的抑菌活性达到最高（抑菌圈直径为26.5mm）。单因素实验结果表明在以2%葡萄糖为碳源，1%酪蛋白胨为氮源，培养基起始pH6.5，在30℃37℃培养24h时发酵上清液的抑菌活性达到最高（抑菌圈直径为32.5mm）。此外，菌株P-347与单增李斯特菌CMCC34005混合培养可提高细菌素产量。菌株P-347所产细菌素有较好的热稳定性（100℃，2h不失去抑菌活性），其显示抑菌活性的pH值范围为pH2.06.0，28%（v/v）的乙醇、26%（w/v）的NaCl及0.51.5%（v/v）的表面活性剂SDS、Tween20、Tween80和尿素对其抑菌活性无影响，而8%（w/v）的NaCl会降低其抑菌活性。随保藏时间的延长，细菌素的抑菌活性有所降低，但低温（-204℃）对抑菌活性无影响。细菌素可抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，但对霉菌和酵母菌的生长没有任何抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 食品防腐剂的种类
• 1.2 天然防腐剂的发展
• 1.2.1 源于植物的天然防腐剂
• 1.2.2 源于动物的天然防腐剂
• 1.2.3 源于微生物的天然防腐剂
• 1.3 细菌素的研究概况
• 1.3.1 细菌素的定义
• 1.3.2 细菌素的分类
• 1.3.3 细菌素的分离提取
• 1.3.4 细菌素的抑菌谱
• 1.3.5 细菌素的应用
• 1.3.5.1 细菌素与食品发酵行业
• 1.3.5.2 细菌素与医疗
• 1.3.5.3 细菌素与生物农药
• 1.3.5.4 细菌素与饲料工业
• 1.3.6 细菌素的展望
• 1.4 乳酸菌和乳酸菌细菌素
• 1.4.1 乳酸菌的定义和分类
• 1.4.2 乳酸菌细菌素的研究概况
• 1.4.3 乳链菌肽（Nisin）
• 1.4.3.1 Nisin 的结构
• 1.4.3.2 Nisin 的抑菌机理
• 1.4.3.3 Nisin 的性质及影响其活性的因素
• 1.4.3.4 Nisin 在食品发酵行业的应用
• 1.4.4 发酵条件对乳酸菌产细菌素的影响
• 1.4.4.1 培养基组分
• 1.4.4.2 培养条件
• 1.4.4.3 诱导物
• 1.5 本论文的选题背景及主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料及仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.1.1 乳酸菌菌种来源
• 2.1.1.2 指示菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 乳酸菌富集培养基
• 2.1.2.2 乳酸菌筛选培养基
• 2.1.2.3 指示菌培养基
• 2.1.2.4 液体种子培养基
• 2.1.2.5 发酵培养基
• 2.1.2.6 斜面培养基
• 2.1.2.7 生理生化培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乳酸菌的分离及初步鉴定
• 2.2.1.1 富集培养
• 2.2.1.2 分离纯化
• 2.2.1.3 过氧化氢酶测定
• 2.2.1.4 乳酸的检测
• 2.2.2 指示菌的制备
• 2.2.3 菌种的活化与种子培养
• 2.2.3.1 菌种活化
• 2.2.3.2 菌种扩大培养
• 2.2.4 有抑菌活性菌株的筛选
• 2.2.4.1 初筛
• 2.2.4.2 复筛
• 2.2.5 产细菌素菌株的鉴定
• 2.2.5.1 生理生化鉴定
• 2.2.5.2 碳水化合物发酵特性鉴定
• 2.2.6 细菌素发酵条件的研究
• 2.2.6.1 菌株 P-347 生长曲线及抑菌活性曲线的测定
• 2.2.6.2 碳源种类
• 2.2.6.3 氮源种类
• 2.2.6.4 氮源用量
• 2.2.6.5 培养基起始 pH 值
• 2.2.6.6 培养温度
• 2.2.6.7 诱导物
• 2.2.7 细菌素特性研究
• 2.2.7.1 热稳定性
• 2.2.7.2 pH 稳定性
• 2.2.7.3 表面活性剂稳定性
• 2.2.7.4 NaCl 对细菌素活性的影响
• 2.2.7.5 乙醇对细菌素活性的影响
• 2.2.7.6 保藏条件对细菌素活性的影响
• 2.2.7.7 抑菌谱测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 乳酸菌的分离及菌种鉴定
• 3.1.1 乳酸菌的分离及初步鉴定
• 3.1.2 有抑菌活性菌株的筛选
• 3.1.2.1 初筛
• 3.1.2.2 复筛
• 3.1.3 乳酸菌菌种鉴定
• 3.1.3.1 生理生化鉴定
• 3.1.3.2 碳水化合物发酵特性鉴定
• 3.2 细菌素发酵条件的研究
• 3.2.1 菌株 P-347 生长曲线及抑菌活性曲线的测定
• 3.2.2 碳源种类
• 3.2.3 氮源种类
• 3.2.4 氮源用量
• 3.2.5 培养基起始 pH 值
• 3.2.6 培养温度
• 3.2.7 诱导物
• 3.3 细菌素的特性研究
• 3.3.1 热稳定性
• 3.3.2 pH 稳定性
• 3.3.3 表面活性剂稳定性
• 3.3.4 NaCl 对细菌素活性的影响
• 3.3.5 乙醇对细菌素活性的影响
• 3.3.6 保藏条件对细菌素活性的影响
• 3.3.7 细菌素的抑菌谱
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 乳酸菌的初步鉴定结果
• 附录 B 乳酸菌初筛结果