溶解氧对里氏木霉产纤维素酶的作用与控制

论文摘要

本文用10g/l的纸浆作碳源,研究了溶解氧在里氏木霉生产纤维素酶过程中的作用与控制。首先在10L生化反应器,固定通风量到25L/（h.l）,通过不控制pH值和控制pH值4.8,研究菌丝生长代谢过程中的H+浓度变化及其对菌丝生长和代谢产酶的影响;通过增加通风量到30L/（h.l）,研究通风量对菌丝生长和产纤维素酶的影响;分别控制溶解氧浓度DOT40%～50%,30%～40%和20%～30%,研究溶解氧浓度对里氏木霉菌丝生长和产纤维素酶的影响。然后在2L生化反应器,分别固定通风量25L/（h.l）和控制DOT20%～30%,测尾气中氧气和二氧化碳含量,研究菌丝生长代谢过程中菌丝对氧的利用和释放二氧化碳的变化,得到结果如下:里氏木霉生长代谢过程中H+浓度会有很大的波动。培养基中的葡萄糖被菌丝利用而产生酸性物质,因而培养液中H+浓度会逐渐上升。同时部分菌丝自溶,会导致H+浓度下降。总结果是培养液中H+浓度大量增加,不利于菌丝生长和代谢产酶。生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶酶活较低,酶解效率较低,48h酶解得率55.7%,72h酶解得率56.7%,72h纤维二糖含量高达0.943g/l。控制培养液pH4.8有利于菌丝生长代谢,提高产酶能力。调节pH值4.8时,最高菌丝质量浓度从2.60 g/l增加到2.77 g/l,提高6.5%,最大滤纸酶活从1.87IU/ml上升到2.79IU/ml,增加0.92IU/ml,提高了49.2%。里氏木霉生长代谢过程中需要较多的溶解氧,增加通风量可增加溶解氧,有利于菌丝生长,提高产酶能力。增加通风量到30L（/h·l）时,溶解氧水平提高,菌丝质量浓度从2.77g/l增加到2.98g/l,提高7.6%,滤纸酶活从2.79IU/ml上升到2.98IU/ml,提高了6.8%。控制pH和增加通风量,不仅提高了纤维素酶活力,提高了纤维素酶得率,而且提高了反应速率,使纤维素酶产率得到了更大的提高。控制pH4.8时,滤纸酶活最高时的酶产率从22.18IU/（h·l）增加到33.26 IU/（h·l）,提高50.0%。增加通风量到30L/（h.l）时,酶活最高时的酶产率从33.26 IU/（h·l）增加到38.21 IU/（h·l）,提高14.9%。控制DOT20%～30%,是里氏木霉菌丝生长代谢的最适宜溶解氧条件。分别控制DOT40%～50%、30%～40%和20%～30%时,菌丝生长依次加快,菌丝的最高质量浓度分别为3.01 g/l、3.06 g/l、3.12 g/l。葡萄糖利用速率加快,纤维素可较早地诱导纤维素酶合成,24h的滤纸酶活分别为0.12IU/ml,0.37 IU/ml,0.63 IU/ml,酶活最高的时间分别为92h,80h和76h。控制DOT20%～30%促进了里氏木霉对纤维素酶的合成。分别控制DOT40%～50%、30%～40%和20%～30%时,纤维素酶滤纸酶活最高分别为3.09IU/ml,3.26IU/ml和3.55IU/ml,纤维素酶的总生产能力比固定通风量30L/（h.l）时分别提高了3.7%,9.4%和19.1%,单位质量菌丝的纤维素酶生产能力分别提高2.7%,6.5%,13.8%。控制DOT20%～30%时,生产的纤维素酶有较合理的酶系结构,不仅滤纸酶活较高,酶解得率也较高,酶解液中纤维二糖含量较低。48h酶解得率为59.26%,纤维二糖含量0.233g/l,72h酶解得率为63.43%,纤维二糖含量0.199g/l。控制DOT20%～30%时,菌丝主要生长代谢时期的通风量增加,氧气的摩尔含量较高。气相中较高的氧含量有利于氧的溶解,加快了氧的传输,使菌丝在快速生长期对氧的摄取率OUR提高,且使氧的摄取率OUR的上升趋势与菌丝的生长量变化相一致。最高菌丝质量浓度增加到3.11g/l,比固定通风量25L/（h·l）时的2.78g/l提高11.8%。菌丝摄氧稳定,有利于细胞质粒的稳定性和基因表达。控制DOT20%～30%,气相中二氧化碳的摩尔含量约0.4%,比固定通风量25L/（h.l）时的0.8%降低了一半。反应液中的溶解二氧化碳可较快地释放到气相中而被排出,体系二氧化碳释放率CER也较高。菌丝生长和代谢都很稳定,0～20h菌丝主要生长期,RQ约0.6左右,20～60h菌丝生长代谢期,RQ在0.8左右,60h以后菌丝主要代谢期,RQ在1左右。控制DOT20%～30%时,纤维素酶的酶得率为354IU/g,比通风量25L/（h.l）时的275IU/g提高28.7%,也就是说纤维素酶的总生产能力提高了28.7%。其中菌丝质量浓度增加11.8%,单位质量菌丝的纤维素酶生产能力提高15.1%,两者共使纤维素酶的总生产能力提高28.7%。同时由于菌丝生长加快,使生产效率提高50.2%。控制pH值4.8,使纤维素酶的滤纸酶活上升到2.79IU/ml,比未控制pH值时的1.87IU/ml提高了49.2%。控制pH值4.8和DOT20%～30%时,可使纤维素酶的滤纸酶活进一步提高到3.54 IU/ml,又提高了26.9%。两步总计提高了89.3%%,即生产能力提高了89.3%。且反应周期从84h缩短到72h,总生产效率提高了120.9%。因此,通过控制pH和控制DOT两种措施,使纤维素酶的生产能力提高了89.3%,使纤维素酶的生产效率提高了120.9%。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 选题的依据
• 2 文献综述
• 2.1 纤维素酶
• 2.1.1 纤维素酶的组成
• 2.1.2 纤维素酶的分子结构
• 2.1.3 纤维素酶的作用机理
• 2.2 纤维素酶的蛋白质工程
• 2.2.1 合理设计
• 2.2.2 定点进化
• 2.2.3 筛选
• 2.2.4 挑选
• 2.3 纤维素酶活力测定
• 2.3.1 内切葡聚糖酶活力
• 2.3.2 外切葡聚糖酶活力
• 2.3.3 β-D-葡萄糖苷酶活力
• 2.3.4 总纤维素酶活力
• 2.4 里氏木霉
• 2.4.1 里氏木霉的特性
• 2.4.2 影响里氏木霉菌丝形态和酶产率的因素
• 2.4.3 影响里氏木霉泡沫行为的因素
• 2.4.4 里氏木霉生长代谢过程中的氧传输
• 2.5 里氏木霉生产纤维素酶动力学
• 2.5.1 里氏木霉纤维素酶生产的特征
• 2.5.2 里氏木霉菌丝生长模型式
• 2.5.3 纤维素酶产物的形成
• 2.5.4 纤维素底物的利用
• 2.6 溶解氧和二氧化碳对发酵的影响
• 2.6.1 溶解氧浓度对发酵的影响
• 2.6.2 发酵液中的溶解氧控制
• 2.6.3 二氧化碳对发酵的影响
• 2.6.4 溶解氧和二氧化碳的同时控制
• 3 PH 和通风量对里氏木霉菌丝生长和产酶的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 发酵方法
• 3.1.4 滤纸酶活的测定
• 3.1.5 CMC 酶活的测定
• 3.1.6 β-葡萄糖苷酶酶活的测定
• 3.1.7 蛋白质质量浓度的测定
• 3.1.8 菌丝和纤维素质量浓度的测定
• 3.1.9 木聚糖酶活的测定
• 3.1.10 DOT 的测定及校正
• 3.1.11 菌丝形态观察
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 菌丝生长代谢过程中pH 值和通风量与DOT 的关系
• 3.2.2 pH 和通风量对里氏木霉菌丝生长代谢的影响
• 3.2.3 pH 和通风量对里氏木霉产酶的影响
• 3.3 本章小结
• 4 溶解氧浓度对里氏木霉菌丝生长和产酶的影响
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌种与培养基
• 4.1.2 发酵方法
• 4.1.3 滤纸酶活、CMC 酶活和β-葡萄糖苷酶酶活的测定
• 4.1.4 蛋白质、菌丝和纤维素质量浓度的测定
• 4.1.5 木聚糖酶酶活的测定
• 4.1.6 纤维素的酶解
• 4.1.7 DOT 的控制方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 控制不同DOT 时菌丝对氧和葡萄糖的利用
• 4.2.2 DOT 对菌丝生长代谢的影响
• 4.2.3 DOT 对里氏木霉产纤维素酶的影响
• 4.2.4 DOT 对里氏木霉产纤维素酶效率的影响
• 4.2.5 纤维素酶的酶解效果分析
• 4.3 本章小结
• 5 控制溶解氧浓度促进里氏木霉产纤维素酶的机理
• 5.1 实验材料和方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 发酵方法
• 5.1.4 滤纸酶活、CMC 酶活和β-葡萄糖苷酶酶活的测定
• 5.1.5 蛋白质、菌丝质量浓度和木聚糖酶活的测定
• 2和O₂ 的摩尔含量的测定'>5.1.6 尾气CO₂和O₂的摩尔含量的测定
• 2 释放率和呼吸商的计算'>5.1.7 摄氧率、CO₂释放率和呼吸商的计算
• 2和O₂ 的摩尔含量的确定'>5.1.8 进气CO₂和O₂的摩尔含量的确定
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 通风量与培养液DOT 的关系
• 5.2.2 控制pH 值时加碱量的变化
• 5.2.3 气相中氧气摩尔含量和摄氧率OUR 的变化
• 5.2.4 气相二氧化碳摩尔含量和二氧化碳释放率CER 的变化
• 5.2.5 菌丝呼吸商RQ 的变化
• 5.2.6 控制DOT20%～30%促进菌丝生长和代
• 5.2.7 控制DOT20%～30%提高了纤维素酶的生产能
• 5.3 本章小结
• 6 本文总结
• 参考文献
• 详细摘要