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人参cDNA文库构建，EST与相关基因表达分析及EST-SSR标记建立

2020-12-05阅读(392)

人参cDNA文库构建，EST与相关基因表达分析及EST-SSR标记建立

论文摘要

人参为五加科多年生草本植物,是我国常用的珍贵药材。人参种质资源主要包括野生人参和栽培人参,野生人参为国家珍稀濒危物种。近年来,栽培人参品质下降、品种混乱、参地连作障害、生产滞销等原因严重破坏了人参种质资源。急需构建人参种质基因库,收集和整理人参宝贵的种质资源。人参作为珍贵的中药材资源,其体内次生代谢产物（人参皂苷等）具有多种生理功能,具有重要的药用价值。人参功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少,完全的基因组和草图序列还有待于建立。因此,保存人参种质资源和加速基因水平的研究进程具有重要意义。本文进行了人参叶片cDNA文库的构建,在此基础上进行了EST的初步分析,部分基因的时空表达分析,利用现有的人参EST资源进行SSR信息分析,人参EST-SSR标记的建立等方面的研究,结果如下:通过四种RNA提取方法提取人参叶片总RNA,其中SDS法能分离出高质量的RNA,可以进行下一步的分子生物学研究;以四年生红果人参叶片为材料,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上。采用电穿孔法将重组质粒转化到DH5a中,成功构建了人参叶片cDNA文库。经文库质量鉴定表明:原始文库滴度为1.008×106pfu·mL-1,扩增后的文库滴度为2.968×109pfu·mL-1,重组率接近100%,插入片段大小范围在0.5～2 kb之间,平均约为0.85 kb,表明应用SMART技术已成功构建了红果人参叶片cDNA文库,可供进一步的EST测序分析使用。对四年生红果人参叶片cDNA文库测序获得441条有效EST序列。GenBank登录号:ES554557-ES554997。441条EST拼接后代表了354个Unigenes。BLAST注释结果表明具有已知或推测功能基因136个,未知功能基因127个,未比对上的基因81个（可能是新基因）。根据BLASTX注释与GO分类结果,并参照MIPs分类标准对354个Unigenes按照生物学功能划分为9个大类:能量与代谢（energy/metabolism,13.8%）、蛋白合成（proteinsynthesis,5.9%）、信号传导（signal transduction,4.8%）、细胞救援与防御（cellrescue。defence,3.1%）、运输（transport,4.8%）、光合作用（photosynthesis,1.9%）、转录（transcription,2.2%）、蛋白活性调节（protein activity regulation,1.69%）、其他（others,61.5%）。采用荧光定量RT-PCR技术研究人参叶、根部的部分基因的表达方式。结果表明,人参中的同一基因在叶、根部的表达模式不完全相同。所选择的基因的表达分别在人参皂苷生物合成途径、三羧酸循环途径、信号传导、抗逆、苯丙氨酸代谢途径等植物次生代谢中发挥重要作用。对人参基因时空表达的研究,将有利于我们进一步研究它们在人参代谢活动过程中的基因表达调控机理。利用现有的7055条人参EST序列搜索出791个SSR,其出现频率为11.21%,平均长度为21.37 bp,平均分布频率为1/5.7 kb。人参EST-SSR的重复类型比较丰富,一至六核苷酸都能观测到。二核苷酸重复是主要的重复类型,占全部EST-SSR的56.89%,其次是三核苷酸重复的占全部SSR的21.11%。AT、GAA是二核苷酸和三核苷酸中出现次数最多的重复基元类型,分别占28.89%和10.18%。表明人参EST中的SSR数量非常丰富。本研究对现有人参EST资源中的SSR进行了分析,明确人参EST中SSR发生频率和分布特征信息,了解人参EST资源的特性,从而为建立其EST-SSR标记及其在人参分子标记的理论研究、人参遗传育种中的应用提供重要的依据。根据搜索出的SSR设计了68对EST-SSR引物,对测试样品进行PCR扩增并检测多态性。分别以人参品种集安长脖和抚松二马牙的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有43对EST-SSR引物能扩增出产物。在9个人参品种、2个西洋参品种和2个刺五加品种中进一步对这些可扩增的引物对进行多态性检测,发现有26对引物显示多态性,占可扩增引物的60.47%,占设计引物总数的38.23%。表明实验建立的EST-SSR标记是一种行而有效的方法,是对现有人参EST资源的进一步开发和利用。建立这种标记对于加速人参EST资源的开发利用、丰富其分子标记类型与绘制遗传图谱、实现特定性状的辅助选择和遗传多样性等研究都具有重要的意义。目前人参中还没有建立EST-SSR标记的报道,本研究根据现有人参EST资源首次建立了EST-SSR标记。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  • 1.1 引言
  • 1.2 人参的研究进展
  • 1.2.1 人参化学成分的研究
  • 1.2.2 人参药理作用的研究
  • 1.2.3 人参分子生物学研究进展
  • 1.3 cDNA 文库的构建策略及其应用
  • 1.3.1 cDNA 文库构建
  • 1.3.2 cDNA 文库的应用
  • 1.4 EST 分析的应用
  • 1.4.1 分离和鉴定新基因
  • 1.4.2 构建遗传学图谱
  • 1.4.3 基因差异表达研究
  • 1.4.4 用于制备 DNA 芯片
  • 1.4.5 利用 EST 数据库进行电子基因克隆
  • 1.4.6 比较基因组学研究
  • 1.5 EST-SSR 标记
  • 1.6 本课题研究的目的和意义
  • 2 人参叶片总 RNA 的提取
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 植物材料
  • 2.1.2 主要试剂及处理
  • 2.1.3 提取方法
  • 2.1.4 总 RNA 质量检测与分析
  • 2.2 结果与分析
  • 2.3 讨论
  • 2.4 本章小结
  • 3 人参 cDNA 文库的构建
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 植物材料
  • 3.1.2 试剂
  • 3.2 试验方法
  • 3.2.1 总 RNA 的提取
  • 3.2.2 cDNA 第一链合成
  • 3.2.3 LD-PCR 合成 ds cDNA
  • 3.2.4 蛋白酶 K 消化
  • 3.2.5 Sfi Ⅰ酶切消化
  • 3.2.6 cDNA 大小片段的分级分离
  • 3.2.7 cDNA 与 pDNR-LIB 载体连接
  • 3.2.8 连接产物的转化
  • 3.2.9 初始文库滴度测定与文库的扩增
  • 3.2.10 文库插入片段长度检测与重组率检测
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 人参叶片总 RNA 的提取
  • 3.3.2 人参的 ds cDNA 的合成
  • 3.3.3 人参的 cDNA 分级分离
  • 3.3.4 cDNA 文库的质量评价
  • 3.4 讨论
  • 3.5 本章小结
  • 4 人参 EST 分析
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 材料
  • 4.1.2 生物信息学分析
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 四年红果人参叶片 EST 序列基本特征统计分析
  • 4.2.2 基因表达丰度
  • 4.2.3 EST 的同源序列比较与功能注释分析
  • 4.2.4 同源序列的物种来源
  • 4.2.5 基因的 GO 分类结果
  • 4.2.6 人参叶片基因的生物学功能分类
  • 4.3 讨论
  • 4.4 本章小结
  • 5 实时荧光定量 RT-PCR 检测人参基因表达
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料
  • 5.1.2 方法
  • 5.2 结果与分析
  • 5.3 讨论
  • 5.4 本章小结
  • 6 人参 EST 资源的 SSR 信息分析
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 人参 EST 来源
  • 6.1.2 人参 EST 中 SSR 的搜索
  • 6.2 结果与分析
  • 6.2.1 人参 EST-SSR 的发生频率
  • 6.2.2 人参 EST-SSR 的特点
  • 6.3 讨论
  • 6.4 本章小结
  • 7 人参 EST-SSR 标记的建立
  • 7.1 材料与方法
  • 7.1.1 供试材料
  • 7.1.2 模板 DNA 的提取
  • 7.1.3 EST-SSR 引物设计与合成
  • 7.1.4 EST-SSR 引物筛选与 EST-SSR 引物多态性检测
  • 7.1.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备
  • 7.2 结果与分析
  • 7.2.1 提取 DNA 的检测
  • 7.2.2 人参 EST-SSR 引物设计
  • 7.2.3 人参 EST-SSR 引物筛选
  • 7.2.4 人参 EST-SSR 引物多态性性分析
  • 7.3 讨论
  • 7.4 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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