产西贝碱内生真菌的诱变及发酵条件的优化

论文摘要

以本实验室保藏的、具有产西贝碱能力的平贝母内生真菌P7为实验菌株。为解决P7菌株在长期保藏过程中出现的退化现象,采用宿主复壮法对其进行了复壮研究,即在培养过程中向培养基中加入平贝母药材,结果表明,当平贝母药材的加入量为3%时,对P7菌株的生长及西贝碱的积累均具有促进作用,且西贝碱产量可达到分离之初菌株西贝碱产量的95.2%,达到了一定的复壮效果,而当加入量超过6%以后,虽对P7菌株的生长仍具有促进作用,但西贝碱的积累却受到明显抑制。为了得到西贝碱的高产菌株,采用传统的诱变方法对P7菌株先进行了单因素诱变,包括紫外、He-Ne激光和亚硝酸处理,在各自较优剂量范围内对其正突变率进行分析得出,对于P7菌株,紫外诱变的效果最好,亚硝酸次之,He-Ne激光较弱。并对各自的正突变菌株进一步筛选,分别得到不同诱变处理的优势菌株。再以它们作为二次出发菌株进行复合诱变处理,最终筛选得到一株高产菌株P-UH-3,其西贝碱产量为0.0881mg/L,菌丝体干重为2.80g/L,分别比原始出发菌株P7的西贝碱产量提高了89.9%,菌体干重提高了18.6%,诱变效果良好,而且P-UH-3菌株具有稳定的遗传特性。为了进一步提高目的产物西贝碱的产量,对P-UH-3菌株的培养条件进行了优化研究。通过比较不同供试培养基中菌丝体生长和西贝碱积累情况,发现最适于菌丝体生长的固体培养基为PDA培养基,而最利于西贝碱积累的液体培养基为豆芽汁蔗糖培养基。并以豆芽汁培养基为基础对P-UH-3菌株的培养条件进行单因素和正交试验优化,结果表明,最利于西贝碱积累的发酵条件为：在豆芽汁培养基的基础上,加入葡萄糖10%,蛋白胨0.15%,培养基起始pH 7.0,种龄为36h,接种量为10%,最佳培养温度26℃,培养时间为7天。与初始培养条件相比,在优化后的发酵条件下,P-UH-3菌株西贝碱的产量为0.1258mg/L,增加了42.8%,而菌丝体干重的变化不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 西贝碱简介
• 1.1.1 西贝碱的性质
• 1.1.2 西贝碱的药理作用
• 1.2 植物内生真菌的研究进展
• 1.2.1 植物内生真菌的多样性
• 1.2.2 药用植物内生真菌在药物研究方面具有的潜在应用价值
• 1.3 微生物育种技术
• 1.3.1 物理诱变
• 1.3.2 化学诱变
• 1.3.3 空间技术诱变
• 1.3.4 原生质体育种技术
• 1.3.5 基因工程育种
• 1.3.6 诱变的处理方式
• 1.4 菌株的退化及复壮
• 1.5 本课题研究的意义及内容
• 第二章 P7菌株产西贝碱能力的验证实验
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 标准品
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的活化
• 2.2.2 种子液的制备
• 2.2.3 供试样品溶液的制备
• 2.2.4 阴性对照溶液的制备
• 2.2.5 P7产西贝碱能力的鉴定
• 2.2.6 回归方程的建立
• 2.3 实验结果及分析
• 2.3.1 P7菌株代谢产物的鉴定
• 2.3.2 回归方程的建立
• 2.3.3 P7菌株西贝碱产量的测定
• 2.4 结论
• 第三章 P7菌株的复壮实验
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株复壮
• 3.2.2 复壮菌株西贝碱产量的测定
• 3.2.3 复壮菌株遗传稳定性的检测
• 3.3 实验结果及分析
• 3.3.1 菌落形态的比较
• 3.3.2 复壮菌株西贝碱产量的测定
• 3.3.3 遗传稳定性
• 3.4 结论
• 第四章 P7菌株的诱变实验
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌悬液的制备
• 4.2.2 单因素诱变
• 4.2.3 复合诱变
• 4.2.4 高产菌株的筛选
• 4.2.5 遗传稳定性的检测
• 4.3 实验结果及分析
• 4.3.1 UV诱变
• 4.3.2 He-Ne激光诱变
• 2诱变'>4.3.3 HNO₂诱变
• 4.3.4 单因素诱变效果的比较
• 4.3.5 UV-激光复合诱变
• 4.3.6 激光-UV复合诱变
• 2复合诱变'>4.3.7 UV-HNO₂复合诱变
• 2-UV复合诱变'>4.3.8 HNO₂-UV复合诱变
• 4.3.9 UV-LiCl的复合诱变
• 4.3.10 复合诱变高产菌株的比较
• 4.3.11 最优菌株的遗传稳定性
• 4.4 结论
• 第五章 发酵条件的优化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验菌株
• 5.1.2 试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 固体培养基的选择
• 5.2.2 液体培养基的选择
• 5.2.3 发酵条件的单因素优化
• 5.2.4 培养条件的正交优化
• 5.3 实验结果及分析
• 5.3.1 不同固体培养基的生长情况
• 5.3.2 液体培养基的选择
• 5.3.3 最佳发酵时间的选择
• 5.3.4 最佳温度的选择
• 5.3.5 最佳起始pH的选择
• 5.3.6 碳源的选择
• 5.3.7 氮源的选择
• 5.3.8 正交优化
• 5.3.9 发酵条件优化
• 5.4 结论
• 小结
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢