论文摘要
ISWI（imitation switch）属于ATP依赖的染色质重塑复合物SWI2/SNF2超家族,它区别于其他SWI2/SNF2相关亚家族的特点是ATP酶亚基ISWI含有SANT结构域及SLIDE结构域。大量研究表明,ISWI家族成员参与细胞核内包括基因表达调控、DNA复制及染色质重塑等众多生物学过程。ISWI最早发现于果蝇,后来发现存在于从酵母到人类多种生物,在进化上高度保守。果蝇Iswi蛋白具有ATP酶水解活性,参与构成果蝇体内NURF、ACF及CHRAC三种复合物,其中NURF复合物参与基因的转录调控,而ACF及CHRAC复合物则与复制过程中核小体的装配及排列密切相关。哺乳动物基因组编码两种ISWI蛋白,SNF2H和SNF2L。与果蝇Iswi类似,哺乳动物ISWI复合物根据其功能也可分为两大类:包含有Snf2h的复合物参与调节DNA复制过程中核小体的装配及排列;包含Snf2l的复合物对终末分化细胞的转录过程发挥基因特异性效应。与SNF2H和SNF2L在功能上存在较大差异一致,二者在时空表达模式上亦存在显著不同。在小鼠,Snf2h广泛表达于各种组织细胞,而Snf2l则仅在神经系统及性腺组织中表达。与小鼠Snf2l基因不同,人类SNF2L基因广泛表达于各种组织,其表达调节是通过不同的剪接体来实现的。人类SNF2L基因产生两种剪接体,SNF2L和SNF2L+13。SNF2L+13剪接体丧失了ATP酶活性,不具有重塑染色体的能力。研究发现,人体中这种无活性的SNF2L+13剪接体主要存在于非神经系统中,而有活性的野生型SNF2L剪接体则高表达于神经组织。因而,无论是在小鼠还是人体内,有功能的SNF2L主要是在神经系统（或生殖系统）中发挥作用。SNF2H和SNF2L不仅存在上述表达空间上的差异,而且在表达时间上也存在明显不同。Snf2h主要在胚胎发育早期处于增殖状态的前体细胞中高表达,而Snf2l则高表达于出生后或已发育成熟的处于末端分化状态的组织中。越来越多的功能研究证实SNF2L基因在生命活动过程中发挥重要作用,但是对该基因的转录调控机制知之甚少。为此,本课题围绕人类SNF2L基因的转录调控进行了以下几个方面的工作:第一部分人类SNF2L基因近侧调控区域初步分析作为研究基因表达调控的第一步,首先应该定位基因的启动子区域。为此,我们首先以人类SNF2L基因cDNA序列的5’序列为目的序列,利用在线BLAST软件从基因库中通过比对分析获取含有该基因转录起始点上游序列的基因组克隆,发现克隆NW927721的9251535-9251734与人类SNF2L基因cDNA序列匹配,进一步分析发现该克隆含有人类SNF2L基因的基因组序列。在此基础上,采用MatInspector软件对人类SNF2L基因转录起始点上游约1kb序列进行转录调控元件筛选,在该区域内未检测到经典的TATA和CAAT保守序列,但检测到NF-κB、Sp1、MZF1、E2F和CRE等重要调控元件,为下一步构建表达载体分析启动子活性奠定了基础。采用荧光素酶报告基因分析系统,我们首先分析了转录起始点至上游-761bp区域片段的启动子活性,由于神经组织是活性SNF2L基因表达区域,我们选择了两种神经细胞PC12和C6细胞以及一种非神经细胞HeLa细胞进行荧光素酶表达活性分析。在三种细胞中,我们都观察到含有人类SNF2L基因转录起始点上游-761bp至+94bp区域的表达载体P-761具有很强的启动子活性,提示调控人类SNF2L基因的基本启动子位于该区域。为进一步定位基本启动子,我们在P-761表达载体的基础上构建了6个系列截短片段的荧光素酶表达载体,这些载体按其5’位置分别命名为:P-650、P-486、P-310、P-185、P-72、P-58。分别用以上载体与作为内对照的表达载体pRL-TK瞬时共转染HeLa、PC12及C6细胞,24h后收集细胞,测定荧光素酶表达活性。发现P-185表达载体荧光素酶表达活性最高,而且在三种细胞中观察到类似表达趋势,提示人类SNF2L基因转录起始点上游-185bp区域内不含细胞特异性调控元件。为便于对比分析,我们把P-185载体的活性设置为100%。与P-185表达载体相比,P-72和P-58表达载体活性很低,接近背景水平,提示转录调控元件位于-185至72bp之间;从-185bp继续缺失至-761bp,荧光素酶表达活性降低50-60%,提示该区域内存在负性调控元件。为进一步定位基本转录调控元件,我们又在P-185表达载体基础上构建了P-152、P-116和P-86三个表达载体,对这些载体的表达活性进行分析表明,人类SNF2L基因的基本调控元件位于-152bp至-116bp和-116bp至-86bp之间。第二部分Sp1在调节人类SNF2L基因基本启动子活性中的作用第一部分研究结果表明在人类SNF2L基因转录起始点上游-152bp至-116bp区域内存在调控该基因基本启动子活性的调控元件,软件分析此区域序列发现,该区域内存在转录因子Sp1结合位点。研究表明,Sp1在多种基因的表达调控中发挥重要作用。为此,我们对Sp1在维持人类SNF2L基因基本启动子活性中的作用进行了分析:首先,对比分析含有Sp1结合位点的表达载体P-152和不含Sp1结合位点的P-116表达载体荧光素酶活性发现,三种细胞中P-116载体的表达活性仅为P-152表达载体的60%左右;第二,为进一步证实该Sp1结合位点的作用,我们在P-152表达载体的基础上,采用PCR方法将Sp1核心序列由GGGGGG突变为TCCTAG,构建了突变型表达载体Sp1-Mut。对比分析野生型和突变型表达载体荧光素酶表达活性发现,突变Sp1结合位点核心序列后导致表达载体荧光素酶表达活性显著降低,而且接近不含Sp1结合位点载体P-116表达水平。进一步证实该位点是人类SNF2L基因基本启动子功能所必需的;第三,为分析细胞内Sp1蛋白水平对人类SNF2L基因基本启动子活性的影响,我们采用RNA干扰方法抑制内源性Sp1蛋白表达。利用构建的Sp1 RNA干扰载体和对照载体稳定转染HeLa细胞,获得Sp1低表达细胞。向Sp1低表达细胞和对照细胞中转染P-152表达载体,荧光素酶活性分析发现降低Sp1蛋白表达导致P-152载体表达活性降低了大约50%;第四,为进一步证实Sp1在人类SNF2L基因基本启动子活性中的作用,我们采用EMSA分析方法,检测了细胞内Sp1与该位点的结合情况。发现标记的野生型探针能特异结合核蛋白形成DNA-蛋白质复合物,非标记野生型探针能有效竞争复合物的形成,而非标记突变型探针未观察到竞争作用。证明该区域的Sp1结合位点能与细胞内Sp1蛋白特异结合。以上研究从Sp1结合位点、Sp1蛋白及Sp1结合位点与Sp1蛋白相互作用三方面证实了Sp1在维持人类SNF2L基因基本启动子功能方面的重要作用。第三部分CREB在调节人类SNF2L基因转录中的作用第一部分研究结果表明在人类SNF2L基因转录起始点上游-116bp至-86bp区域存在功能性调控元件,软件分析提示该区域内存在CRE位点。CRE位点可以通过结合CREB/ATF家族转录因子而发挥组成性或诱导性调控作用。为此,本部分围绕CRE位点进行了分析:首先,对比分析小鼠、大鼠和人SNF2L基因近侧CRE位点相应区域,发现该区域在进化上高度保守,CRE位点的相对位置和核心及周围序列都十分一致,支持该区域的CRE位点在人类SNF2L基因的转录调控中起重要作用;第二,对比分析含CRE位点的表达载体P-116和不含CRE位点表达载体P-86的荧光素酶表达活性发现,缺失CRE位点导致人类SNF2L基因启动子活性大幅度降低,表明该位点存在的重要性;第三,为进一步证实该位点的作用,我们利用PCR扩增方法在P-116表达载体基础上通过将CRE位点的关键序列由TGACGTAG突变为CTCTGTAG,构建了CRE突变载体。对比分析P-116野生型和突变型表达载体荧光素酶表达活性发现,改变CRE位点核心序列可有效降低人类SNF2L基因启动子活性,而且突变型表达载体荧光素酶活性接近于不含CRE位点的表达载体P-86,再次证明该CRE位点为人类SNF2L基因启动子功能维持所必需;第四,为分析细胞内CREB/ATF家族转录因子对人类SNF2L基因表达的影响,我们采用RNA干扰方法抑制细胞内CREB蛋白表达,获得了CREB低表达和表达对照载体的稳定细胞,将P-116载体转染这些稳定细胞,荧光素酶活性分析发现降低细胞内CREB蛋白水平能显著减少人类SNF2L基因启动子活性。说明不仅CRE位点是维持人类SNF2L基因基本启动子功能所必需的,而且CRE位点结合蛋白CREB也为人类SNF2L基因启动子功能所必需;第五,为证实该位点与细胞内转录因子之间的相互作用,我们设计并合成了针对该位点的野生型和突变型探针进行EMSA分析,发现标记的野生型探针能形成DNA-蛋白质复合物,而且这种复合物可以通过加入未标记的野生型探针而竞争消失,而加入未标记的突变型探针不影响复合物的形成。证明该CRE位点能与细胞内转录因子特异结合;第六,为确定本研究所鉴定的CRE位点是否存在诱导调节作用以及cAMP-PKA通路激活剂是否能刺激神经细胞SNF2L基因表达,我们选择了两种cAMP-PKA激活物——Foskolin和dbcAMP,分析其对SNF2L基因启动子活性和细胞内SNF2L表达水平的影响。对SNF2L基因启动子活性分析发现,Foskolin和dbcAMP对人类SNF2L基因启动子的诱导作用存在细胞差异,在HeLa和PC12细胞检测到一定的诱导作用,但在C6细胞没有观察到显著诱导效应。然而,对PC12细胞和大鼠卵巢癌NuTu19细胞内源性Snf2l基因mRNA的定量分析发现,Foskolin和dbcAMP并不能诱导Snf2l基因表达上调。以上实验从DNA、转录因子以及DNA与转录因子相互作用三个方面证实了人类SNF2L基因启动子区域的CRE位点及其相互作用的转录因子CREB在维持人类SNF2L基因基本启动子活性上发挥重要作用。人类SNF2L基因转录起始点上游近侧的CRE位点主要参与组成性基因表达调控。第四部分人类SNF2L基因基本启动子上游负性调控元件分析第一部分分析结果表明缺失-761bp至-185bp区域导致荧光素酶表达活性显著降低,提示该区域内存在负性表达调控元件。采用MatInspector V2.2软件对该区域序列进行分析,发现该区域内存在多个可能起负性调控作用的转录因子结合元件,包括YY1、POZ/ZF、Blimp-1、E4BP4、NRSE和En-1等,为深入了解SNF2L基因的转录调控机制,我们对该区域进行了突变分析。1.对比分析P-486与P-185表达载体荧光素酶活性发现,缺失从-486bp至-185bp区域导致表达活性降低了近20%,软件分析发现该区域内存在可能起负性表达调控作用的调控元件YY1。因此,以P-486为模板构建了该区域YY1元件突变的荧光素酶表达载体YY1-Mut,其荧光素酶表达活性并没有明显升高,而是低于野生型P-486表达载体,提示该区域的YY1元件并不是人类SNF2L基因的负性调控元件;2.为了进一步精细定位-486bp至-185bp区域的负调控元件,我们又构建了缺失型荧光素酶表达载体P-396。双荧光素酶检测结果显示其表达活性比P-486载体活性略低,较P-185有明显的下降,提示调控区-486bp至-185bp之间的负性调控元件可能主要位于-396bp至-185bp之间;3.在-396bp至-185bp区域内存在NRSE（neural-restrictive silencer element）和En-1（Homeobox protein engrailed）结合位点,我们针对以上两个负调控元件分别构建了突变载体NRSE-Mut和En-1-Mut。双荧光素酶活性检测的结果显示突变NRSE位点显著降低荧光素酶表达活性,突变En-1元件未检测到明显效应。提示该区域内的这两个元件都不能单独发挥抑制功能而对SNF2L转录的负调控具有决定性影响;4.在-761bp至-486bp区域内含有重要转录因子POZ/ZF、Blimp-1和E4BP4结合位点,针对以上三个可能起负调控作用的元件,我们分别构建了突变型表达载体POZ/ZF-Mut、Blimp-1-Mut和E4BP4-Mut,并与其对应的野生型表达载体对比进行了荧光素酶表达活性分析,发现突变这些位点均导致荧光素酶表达活性不同程度的降低,提示该区域内的这3个元件都不能单独发挥抑制功能而对SNF2L转录的负调控具有决定性影响。尽管目前的实验未能鉴定出负性调控元件,但缺失分析结果确实表明在-761bp至-185bp区域内存在负性调节,这种负性调节的机制有待于进一步分析证实。