抑制性消减杂交技术克隆肾细胞癌转移相关基因

论文摘要

肾细胞癌（Renal Cell Carcinoma,RCC）是泌尿系常见恶性肿瘤,其发病率占全身恶性肿瘤的3%,全世界的发病率每年递增2%,死亡人数逐年上升。肾癌的主要治疗方法是外科手术,化疗、放疗、激素治疗均不敏感,尤其是晚期肾癌的治疗效果不容乐观。因此,如何实现肾细胞癌的早期诊断、早期治疗成为我们在临床工作中需要迫切解决的问题。抑制性消减杂交（Suppression subtractivehybridization,SSH）是以消减杂交为基础结合抑制性PCR建立起来的分离克隆差异表达基因的方法,是近年发展起来的筛选、克隆差异表达基因的一种有效手段。我们采用抑制性消减杂交（SSH）技术构建高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞差异表达的cDNA消减文库,初步筛选并克隆肾细胞癌转移相关基因,为建立一套检测肾细胞癌转移的生物学标志和治疗的新靶点奠定了基础。目的:构建高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆肾细胞癌转移相关基因;方法:以高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞为研究对象,进行抑制性消减杂交分析:分别提取细胞Total RNA,合成双链cDNA,经RsaI酶切后将高侵袭性肾癌细胞cDNA分为两组并加上不同的接头,再与过量低侵袭性肾癌细胞cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与T/A载体连接并转化大肠杆菌构建构建cDNA消减文库,以菌液PCR的方法检测随机挑选的阳性克隆,送检测序,利用BLAST软件进行同源性分析,半定量RT-PCR方法检测肾细胞癌转移相关基因在肾癌原发组织和转移组织中的差异表达;结果:成功构建高侵袭性肾癌细胞和低侵袭性肾癌细胞差异表达的cDNA消减文库,获得185个阳性克隆,随机挑取50个阳性克隆进行PCR分析,其中90%克隆均含500bp～1200bp插入片段,测序及BLAST分析发现7个基因片段;结论;抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段,所筛选的肾细胞癌转移相关基因可做为检测肾细胞癌转移的生物学标志并为治疗的新靶点提供实验基础;

论文目录

• 中英文缩略表
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• 英文摘要
• 前言
• 第一部分: 抑制性消减杂交分析高、低侵袭性肾癌细胞
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 筛选并克隆肾细胞癌转移相关基因
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 进一步研究方向
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 综述
• 参考文献