可注射性聚乳酸细胞微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的构建

论文题目: 可注射性聚乳酸细胞微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的构建

论文类型: 博士论文

论文专业: 材料学

作者: 洪奕

导师: 沈家骢,高长有

关键词: 可注射性,聚乳酸细胞微载体,壳聚糖水凝胶,复合支架,软骨细胞

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本文构建了组织工程中可注射性聚乳酸细胞微载体/壳聚糖凝胶复合支架。首先,制备了聚乳酸微球,并对其表面进行修饰,得到具良好细胞相容性的细胞微载体;其次,制备了可聚合的水溶性壳聚糖,可在温和条件下交联形成壳聚糖水凝胶;最后,将细胞微载体与壳聚糖凝胶复合形成新型的可注射性支架。 采用乳化溶剂挥发法制各了聚乳酸微球。通过调节搅拌速度、聚乳酸浓度和分散剂浓度,获得了不同粒径及粒径分布的聚乳酸微球。在此基础上,采用乳化溶剂挥发法和液致相分离相结合制备了聚乳酸多孔微球。它的表面存在大量的小孔,内部为不规则的多孔结构。通过调节搅拌速度、不良溶剂/良溶剂比、聚乳酸浓度和分散剂浓度,不仅能控制多孔微球的粒径及粒径分布,还能控制多孔微球内部孔径的大小。其内部平均孔径最大可达30μm。 以180～280μm的聚乳酸微球为模板,采用胺解和接枝涂层技术相结合的方法,在聚乳酸微球表面固定生物大分子,如胶原和壳聚糖,以提高细胞相容性。胺解过程中,微球重量随胺解时间的延长而线性下降,而微球表面的自由氨基随胺解时间的延长,先增加后恒定在一稳定值。采用戊二醛为偶联剂,将胶原和壳聚糖接枝涂层在聚乳酸微球表面。胶原和壳聚糖的固定量均随自由氨基含量的增加而增大。体外软骨细胞实验表明,与未改性的聚乳酸微球相比较,胶原涂层和壳聚糖涂层聚乳酸微球的细胞相容性都得到提高,且前者优于后者。 以碳化二亚胺为缩合剂,将甲基丙烯酸和乳酸依次接枝在壳聚糖分子链上,获得了可聚合的水溶性壳聚糖(CML)。采用FTIR、~1HNMR以及元素分析证明了甲基丙烯酸(MA)和乳酸(LA)在壳聚糖分子链上的接枝。且二者的接枝量可由碳化二亚胺的加入量进行控制。壳聚糖衍生物(含23%MA和52%LA)在pH值为9时才发生沉淀。衍生物水溶液的粘度也较低,1%时,粘度只有～40cp(50rpm)。 在氧化还原引发体系过硫酸铵与四甲基乙二胺作用下,壳聚糖衍生物交联形成壳聚糖水凝胶。荧光探针芘检测结果表明交联反应速率主要依赖于引发剂的浓度,而对大分子单体浓度依赖性较小。其凝胶时间随着引发剂浓度的增加而下降,随温度的升高而减少。当引发剂浓度为5mM时,1%CML在25℃和37℃下的凝胶时间分别为～20min和5.5min。平衡溶胀比随引发剂浓度的增加先下降后不变,对离子浓度的变化非常敏感,在培养基和PBS中的平衡溶胀比只有在水中的1/3左右。壳聚糖水凝胶的降解与交联度有关,且对溶菌酶比较敏感。在1mg/ml的溶菌酶/PBS溶液中,水凝胶(CML-15)8天内就完全降解。但凝胶的弹性模量远低于正常软骨的弹性模量。

论文目录:

第一章 文献综述

1．1 组织工程简介

1．2 生物材料与三维支架

1．3 可注射性支架

1．3．1 可注射性水凝胶支架

1．3．1．1 水凝胶固化机理

1．3．1．1．1 热致相转变

1．3．1．1．2 自由基交联

1．3．1．1．3 离子交联

1．3．1．1．4 生物特异性结合

1．3．1．2 胶原／明胶

1．3．1．3 纤维蛋白

1．3．1．4 透明质酸

1．3．1．5 琼脂糖

1．3．1．6 海藻酸钠

1．3．1．7 壳聚糖

1．3．1．8 聚乙二醇(聚氧化乙烯)及其共聚物

1．3．1．9 聚反丁烯二酸丙二醇酯

1．3．1．10 聚N-异丙基丙烯酰胺

1．3．2 可注射性细胞微载体

1．4 课题的提出

第二章 聚乳酸微球的制备和表征

2．1 试验部分

2．1．1 主要原材料和试剂

2．1．2 聚乳酸微球的制备

2．1．3 多孔聚乳酸微球的制备

2．1．4 测试与表征

2．2 结果与讨论

2．2．1 聚乳酸微球的制备

2．2．1．1 搅拌速度对聚乳酸微球性能的影响

2．2．1．2 聚乳酸浓度对聚乳酸微球性能的影响

2．2．1．3 分散剂浓度对聚乳酸微球性能的影响

2．2．2 多孔聚乳酸微球的制备

2．2．2．1 搅拌速度对多孔聚乳酸微球性能的影响

2．2．2．2 不良溶剂／良溶剂比对多孔聚乳酸微球性能的影响

2．2．2．3 聚乳酸浓度对多孔聚乳酸微球性能的影响

2．2．2．4 分散剂浓度对多孔聚乳酸微球性能的影响

2．3 本章小结

第三章 聚乳酸细胞微载体的制备和表征

3．1 试验部分

3．1．1 原材料和试剂

3．1．2 聚乳酸微球的制备

3．1．3 聚乳酸微球的表面胺解

3．1．4 Ⅰ型胶原在胺解PLA微球表面的接枝涂层

3．1．5 壳聚糖在胺解PLA微球表面的接枝涂层

3．1．6 测试和表征

3．1．7 软骨细胞培养

3．1．7．1 试剂和原料

3．1．7．2 软骨细胞分离及培养

3．1．8 胶原涂层聚乳酸微球的细胞相容性

3．1．9 壳聚糖涂层聚乳酸微球的细胞相容性

3．2 结果与讨论

3．2．1 聚乳酸微球的胺解

3．2．2 Ⅰ型胶原在氨基化聚乳酸微球表面的接枝涂层

3．2．3 胶原涂层聚乳酸微球的细胞相容性

3．2．4 壳聚糖涂层聚乳酸微球的制备和细胞相容性

3．3 本章小结

第四章 共价交联壳聚糖水凝胶的制备和表征

4．1 试验部分

4．1．1 原材料和试剂

4．1．2 水溶性可共价交联壳聚糖的合成

4．1．3 壳聚糖水凝胶的形成

4．1．4 测试和表征

4．1．5 3T3成纤维细胞的体外培养

4．1．6 CML的细胞毒性

4．1．7 水凝胶的细胞毒性

4．1．8 3T3成纤维细胞和软骨细胞的包覆试验

4．1．9 水凝胶在动物体内的炎症反应

4．2 结果与讨论

4．2．1 水溶性可共价交联壳聚糖的制备

4．2．2 壳聚糖衍生物的水溶性

4．2．3 壳聚糖衍生物水溶液的粘度

4．2．4 壳聚糖水凝胶的形成

4．2．5 壳聚糖水凝胶的凝胶时间

4．2．6 壳聚糖水凝胶的平衡溶胀比

4．2．7 壳聚糖水凝胶的微孔孔径

4．2．8 壳聚糖水凝胶的粘弹性

4．2．9 壳聚糖水凝胶的体外降解

4．2．10 壳聚糖衍生物的3T3细胞毒性

4．2．11 壳聚糖水凝胶的3T3细胞毒性

4．2．12 3T3细胞在壳聚糖水凝胶中的生长

4．2．13 软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的生长

4．2．14 壳聚糖水凝胶的体内炎症反应

4．3 本章小结

第五章 可注射性细胞微载体／壳聚糖水凝胶复合支架的构建

5．1 试验部分

5．1．1 原材料和试剂

5．1．2 KGM／CML水凝胶的制备

5．1．3 微载体在水凝胶前驱物中悬浮的定性观察

5．1．4 微载体与KGM／CML水凝胶的复合

5．1．5 KGM的3T3细胞毒性

5．1．6 软骨细胞在细胞微载体／KGM／CML水凝胶复合支架中的包覆

5．1．7 测试与表征

5．2 结果与讨论

5．2．1 魔芋葡甘聚糖及其粘度

5．2．2 KGM／CML凝胶的制备与表征

5．2．2．1 KGM／CML凝胶的凝胶时间

5．2．2．2 KGM／CML凝胶的平衡溶胀比

5．2．2．3 KGM／CML凝胶的粘弹性

5．2．3 微载体与KGM／CML凝胶的复合

5．2．4 KGM的3T3细胞毒性

5．2．5 负载软骨细胞的微载体与软骨细胞在凝胶中的包覆

5．3 本章小结

结论

建议与展望

参考文献

作者简介

致谢

发布时间: 2006-05-10

参考文献

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