绒山羊毛囊体外培养及雌二醇对毛囊Bcl-2、Bax表达的影响

论文摘要

绒山羊毛囊是羊毛、羊绒的发生器官,羊绒品质主要由其控制,因此研究影响毛囊生长的因素及调控其生长衰退的机理对于研究毛囊的发育和毛发的生长有着巨大的意义。由于体内影响毛囊生长的因素众多,不利于单一因素对毛囊生长的研究,因此建立体外游离毛囊培养模型,以尽量避免体内复杂因素的影响。寻找游离绒山羊毛囊培养的最佳条件,通过对毛囊细胞生物学的研究,探讨毛囊生长发育的调控机制和影响毛囊生长的因素。针对以上相关问题,本论文以绒山羊毛囊体外培养为基础,并比较了不同培养基对毛囊培养的影响;利用组织法和消化法进行了毛乳头细胞的分离、培养、传代和冻存;通过对游离绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊的培养,观察不同毛囊各生长阶段的组织结构特征;应用绒山羊毛囊体外培养模型研究雌激素对体外绒山羊初级毛囊生物学特性的影响;又进一步从分子生物学水平,利用体外培养的绒山羊皮片研究雌激素对Bcl-2、Bax基因表达量的调节作用。试验结果如下:1.对传统分离方法进行改进,参照Philpott[55]的方法,通过显微解剖法和切割法的结合,将绒山羊皮肤剪成大约（3～5）mm×10mm大小的皮片（只含单层毛囊）,当毛囊宽度适宜时可以获得更多的游离毛囊,应选用外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润光滑的生长期毛囊进行培养。同时为了便于观察和测量以及毛囊的生长,我们认为分离后的毛囊长度约为2～3mm时最适合毛囊的生长和观察。2.成功进行了游离毛囊的体外培养,并发现初级毛囊在含血清DMEM培养基中生长速度缓慢,扭曲变形早,平均在4天左右开始贴壁;而使用无血清DMEM培养基初级毛囊生长天数明显延长,毛囊的层次结构及形态可长时间保持不变,但从第2天开始生长速度与含血清培养时无明显差异（P>0.05）;使用Williams E无血清培养基初级毛囊在前5天生长速度明显加快,而初级毛囊在Williams E无血清无转铁蛋白培养基中生长速度较Williams E无血清培养的慢,但毛囊存活时间与在Williams E无血清培养基中的无明显差别（P>0.05）,说明转铁蛋白有助于毛囊的生长和形态的维持。实验证明Williams E无血清培养更适合于绒山羊毛囊的体外培养。3.利用Williams E无血清培养基对绒山羊次级毛囊进行培养,前3天的平均生长速度为0.031mm/d,接近于绒山羊体内绒毛同期生长的平均情况（0.056mm/d）,但次级毛囊的生长时间有限,维持时间短。4.对不同时期初级毛囊进行体外培养,结果发现11月份的初级毛囊前3天的平均生长速度为0.08mm/d,与体内初级毛囊同期的平均生长情况相同（0.08mm/d）,且体外培养单天生长速度最大值（0.09mm/d）大于体内单天生长速度的最大值（0.087mm/d）。生长情况好于体外9月份的生长情况,与初级毛囊在体内的活性在9月份达到最高峰相反,由此可以推断毛囊的活性与温度密切相关。5.利用胶原酶消化和机械分离相结合的方法分离处于生长期的内蒙古绒山羊初级毛囊毛乳头细胞,并成功培养。在倒置显微镜下毛乳头细胞呈成纤维细胞形态,具有多层凝集特性。6.对体外游离山羊初级毛囊与绵羊毛囊的生长进行比较。在培养过程中,绵羊毛囊的日平均生长速度明显高于绒山羊毛囊的生长速度,但各自在前3天的生长均能保持相对稳定的水平,并与体内毛囊的生长速度接近。随着培养时间的延长,绵羊毛囊的生长速度急剧下降,而绒山羊初级毛囊在前9天的生长情况始终较为稳定,毛囊形态变化较规律。表明:选择31℃、Williams E无血清培养基进行绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊培养有利于毛囊的生长。7. 17-β-雌二醇对绒山羊初级毛囊的生长没有促进作用。0.1nmol/L组与对照组生长速度无明显差异（P>0.05）,这可能与此浓度与体内雌二醇生理浓度（0.05～0.19nmol/L[244]）基本相同,且毛囊生长速度略好与对照组,在前10d基本保持在一个相对较快的水平上,在培养后期部分毛囊会出现下段弯曲。随着17-β-雌二醇浓度的增加毛囊的生长受到抑制,100nmol/L组对毛囊的生长明显抑制（P<0.01）,大部分毛囊在培养第9d左右停止生长进入退行期。8.体外培养24h的山羊皮片,分别添加不同浓度的17-β-雌二醇,分别培养24h、48h、72h、96h、120h后运用实时定量PCR方法检测凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达情况。结果显示:添加了雌二醇的各组毛囊Bcl-2mRNA表达量随浓度的增加而逐渐减少,说明在雌二醇的作用下,体外培养毛囊的Bcl-2mRNA表达显著下降。而Bax mRNA表达量各组均表现出先增加后逐渐下降的趋势。雌二醇能够降低Bcl-2/Bax mRNA比率,但各组二者比值（Bcl-2/Bax）之间均无显著差异,由此可以推断雌二醇具有促进毛囊细胞凋亡的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 绒山羊皮肤及毛囊
• 1.1.1 绒山羊皮肤结构特点
• 1.1.2 毛囊的分类及结构
• 1.1.3 毛囊的周期性变化
• 1.1.4 毛囊各种细胞生物学特性的研究
• 1.2 毛囊的体外培养及相关因子对其影响的研究进展
• 1.2.1 毛囊培养的研究进展
• 1.2.2 毛囊的分离方法
• 1.2.3 游离毛囊的培养
• 1.2.4 影响毛囊生长相关因子的研究进展
• 1.3 毛囊细胞凋亡的研究进展
• 1.3.1 细胞凋亡的概念
• 1.3.2 Bcl-2 与细胞凋亡
• 1.3.3 Bax 与细胞凋亡
• 1.3.4 Bc1-2 和Bax 与细胞凋亡
• 1.3.5 毛囊细胞凋亡的研究现状
• 1.3.6 细胞凋亡的研究意义
• 1.4 实时荧光定量 PCR 技术
• 1.4.1 实时定量 PCR 的技术原理
• 1.4.2 常用的定量 PCR 方法
• 1.4.3 实时荧光定量 PCR 技术的应用概况
• 1.5 本研究的目的及意义
• 1.6 研究内容和方法
• 1.6.1 主要研究内容
• 1.6.2 研究方法
• 2 试验一 绒山羊毛囊的分离培养
• 2.1 材料
• 2.1.1 材料来源
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 离体绒山羊皮肤毛囊的分离培养
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 毛囊的分离方法
• 2.2.3 毛囊的选取
• 2.2.4 毛囊分组
• 2.2.5 观测指标
• 2.2.6 统计学分析
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 培养初级毛囊生长长度测定
• 2.3.2 初级毛囊在四种培养基中的生长曲线
• 2.3.3 初级毛囊在四种培养基中的显著性检验
• 2.3.4 不同培养基中体外培养的初级毛囊的形态变化
• 2.3.5 次级毛囊的培养情况
• 2.3.6 不同时间初级毛囊体外生长情况的比较
• 2.4 讨论
• 2.4.1 绒山羊毛囊的分离
• 2.4.2 绒山羊毛囊体外培养
• 2.4.3 绒山羊毛囊的体外生长分析
• 2.5 结论
• 3 试验二 内蒙古绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的分离培养
• 3.1 材料
• 3.1.1 材料来源
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 培养基的配置
• 3.2.2 毛乳头细胞的原代培养
• 3.2.3 毛乳头细胞的传代培养及冷冻复苏
• 3.2.4 初级毛囊毛乳头细胞生长曲线的绘制
• 3.2.5 初级毛囊毛乳头细胞染色体检查
• 3.3 结果
• 3.3.1 绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的原代培养
• 3.3.2 绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的生长曲线
• 3.3.3 绒山羊初级毛囊毛乳头细胞的染色体检查
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 4 试验三 体外培养游离山羊初级毛囊与绵羊毛囊生长的比较
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料来源
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 离体山羊初级毛囊及绵羊毛囊的分离培养
• 4.2.1 培养基的配制
• 4.2.2 毛囊的分离方法
• 4.2.3 毛囊的选取
• 4.2.4 观测指标
• 4.2.5 统计学分析
• 4.3 试验结果
• 4.3.1 培养毛囊生长长度测定
• 4.3.2 山羊及绵羊毛囊体外培养的生长曲线
• 4.3.3 体外培养山羊及绵羊毛囊的形态
• 4.3.4 绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊在 Williams E 无血清培养基中的显著性检验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 毛囊的分离
• 4.4.2 毛囊的培养
• 5 试验四 17-β-雌二醇对体外培养毛囊生长的影响
• 5.1 材料
• 5.1.1 材料来源
• 5.1.2 仪器与主要试剂
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 主要试剂的配制
• 5.2.2 绒山羊初级毛囊的分离
• 5.2.3 毛囊的选取
• 5.2.4 毛囊分组
• 5.2.5 观测指标
• 5.2.6 统计学分析
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 17β-E2对绒山羊初级毛囊体外培养生长速度的影响
• 5.3.2 不同浓度17β-E2中绒山羊初级毛囊的生长曲线
• 5.3.3 17β-E2对绒山羊初级毛囊生长形态的影响
• 5.3.4 初级毛囊在添加了不同浓度17-β-雌二醇的培养基中的显著性检验
• 5.4 讨论
• 6 试验五 山羊皮肤毛囊中 Bcl-2、Bax 基因表达
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 主要仪器和试剂
• 6.1.3 PCR 引物的设计及合成
• 6.1.4 山羊皮肤毛囊总 RNA 的提取及检测
• 6.1.5 RT-PCR 产物cDNA 的序列测定
• 6.1.6 序列分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 山羊皮肤毛囊总 RNA 的检测结果
• 6.2.2 山羊皮肤毛囊 RT-PCR 扩增结果
• 6.2.3 山羊皮肤毛囊 PCR 产物的序列分析结果
• 6.2.4 山羊 Bcl-2cDNA 与其他哺乳动物的 Bcl-2cDNA 的同源性比较
• 6.2.5 山羊 Bcl-2 于其它哺乳动物 Bcl-2 氨基酸序列的同源性分析
• 6.2.6 山羊 Bax cDNA 与其它哺乳动物的 Bax cDNA 的同源性比较
• 6.2.7 山羊 Bax 部分氨基酸序列与其它哺乳动物 Bax 的同源性
• 6.3 讨论
• 7 试验六 17-β-雌二醇对毛囊体外培养过程中 Bcl-2、Bax mRNA 表达的影响
• 7.1 材料
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.2 仪器及试剂
• 7.1.3 PCR 引物的设计及合成
• 7.2 方法
• 7.2.1 毛囊总 RNA 的提取
• 7.2.2 实时荧光定量 RT-PCR 检测培养毛囊 Bcl-2、Bax 表达的方法
• 7.2.3 试验数据处理
• 7.3 结果
• 7.3.1 总 RNA 的电泳检测
• 7.3.2 荧光定量 RT-PCR 检测培养的毛囊 Bcl-2、Bax 表达定量方法的确定
• 7.3.3 添加17-β-雌二醇对培养毛囊Bcl-2 和Bax 表达的影响
• 7.4 讨论
• 8 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 附录