高效好氧反硝化菌的分离鉴定及固定化技术的应用研究

论文摘要

目前我国水体富营养化日益严重,水产养殖过程中过量的氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素的治理已成为一个热点问题。好氧反硝化微生物在水体富营养化的脱氮处理中发挥着重要的作用,因此筛选分离高效好氧反硝化菌株并对其研究有着重要的意义。本研究利用富集培养的方法从江西南昌市和安徽六安市郊某养鱼塘采样分离出23株反硝化细菌,其中8株反硝化率较高,从中选择一株效果最好的作为研究对象,命名为HS-N62。通过形态学特性和生理生化分析以及16S rDNA序列分析,菌株HS-N62与假单胞菌（Pseudomonas sp.）亲缘关系最为接近,相似性达99%,初步鉴定该菌为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。对菌株HS-N62的生长特性进行了深入研究,结果表明：在硝酸盐氮初始浓度140 mg/L时,菌株HS-N62在12 h内对硝酸盐氮的去除率可达96%,而且没有NO2-的积累,并且能耐受较高浓度的硝酸盐氮。菌株HS-N62还能以亚硝酸盐氮为唯一氮源生长且有较高的去除效率。环境单因素分析该菌的最适生长温度范围为30℃～37℃,最适生长pH范围是6.0～8.0,最适C/N比为10：1,并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件,菌株HS-N62的最佳条件组合为：丁二酸钠为碳源,C/N为10:1,pH 7.0,35℃,与单因素分析基本一致。研究发现反硝化菌株HS-N62还具有较好的除磷能力,12 h除磷率达到67.7%（初始磷酸盐浓度57 mg/L）。亚硝酸盐还原酶基因分析,证明菌株HS-N62含有亚硝酸盐还原酶基因nirK基因,测序结果表明其序列与Uncultured bacterium HM628847的nirK相似性较高。本研究还通过对传统的聚乙烯醇-硼酸固定化方法优化改进,采用聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）混合作为包埋剂,添加SiO2和CaCO3粉末增强小球颗粒的强度,并将菌株HS-N62与粉末活性炭充分吸附后包埋固定制成小球。在SC培养基中测定硝酸盐氮的去除率,PVA固定化小球第一次使用时在12 h和24 h硝酸盐氮去除率分别达到57.3%和87.2%,重复使用时在12 h时硝酸盐氮就能完全去除,几乎没有亚硝酸盐氮的积累。相对于传统的聚乙烯醇-硼酸固定化方法,该方法制备PVA小球较为容易,并且能明显提高了固定化球的传质性能和通透性,提高了硝酸盐氮的去除能力,并能重复使用。对固定化反硝化菌与游离反硝化菌处理SC培养基进行比较,实验结果表明：固定化反硝化菌在不适宜的温度和pH值条件下均比游离菌具有明显的耐受性,表现出良好的除氮能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 废水处理的脱氮技术与方法
• 1.1.1 水体污染的来源及危害
• 1.1.2 物理化学脱氮方法
• 1.1.3 生物脱氮方法
• 1.2 生物反硝化
• 1.2.1 生物反硝化的原理与过程
• 1.2.2 生物反硝化的功能基因
• 1.3 固定化微生物反硝化工艺
• 1.3.1 固定化技术的发展
• 1.3.2 固定化方法分类
• 1.3.3 固定化生物的优越性及其应用
• 1.4 本文研究的目的和意义
• 第二章 高效好氧反硝化菌的分离及特性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 好氧反硝化细菌的富集培养和菌种分离
• 2.2.2 菌体形态和生理生化鉴定
• 2.2.3 16S rDNA的PCR扩增与序列分析
• 2.2.4 反硝化能力的测定
• 2.2.5 不同因素条件下硝酸盐氮去除能力的测定
• -和NO₂^-耐受度检测'>2.2.6 菌株NO^-和NO₂^-耐受度检测
• 2.2.7 菌株聚磷能力的测定
• 2.2.8 反硝化细菌的亚硝酸盐还原酶基因的鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 好氧反硝化菌株的筛选与鉴定
• 2.3.2 好氧反硝化菌HS-N62的形态学特征及生理生化鉴定
• 2.3.3 菌株HS-N62 16S rDNA的序列测定与分析
• 2.3.4 菌株HS-N62反硝化和聚磷能力的测定
• 2.3.5 菌株HS-N62反硝化特性的研究
• 2.3.6 菌株HS-N62反硝化最适条件的确定
• 3^-/NO₂^-耐受度检测'>2.3.7 菌株HS-N62的NO₃^-/NO₂^-耐受度检测
• 2.3.8 亚硝酸盐还原酶基因的扩增及nirK基因的测序分析
• 2.3.9 铜离子对nirK基因的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 反硝化细菌的固定化技术及应用
• 3.1 菌株与药品
• 3.1.1 菌株与培养基
• 3.1.2 实验药品
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 固定化反硝化菌小球的制备
• 3.2.2 固定化小球的反硝化活性测定
• 3.2.3 不同因素对反硝化作用的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 固定化小球的稳定性测定
• 3.3.2 反硝化菌HS-N62固定化反硝化性能的测定
• 3.3.3 温度对固定化反硝化菌HS-N62的影响
• 3.3.4 pH对固定化反硝化菌HS-N62的影响
• 3.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢