桑树内生真菌的分离鉴定及产油菌Macrophomina phaseolina MOD-1的研究

论文摘要

目前,国内外学者已对多种经济林木和药用植物内生真菌及其次生代谢产物等多方面内容进行过研究,发现植物内生真菌普遍存在于各种植物中,在植物体内能产生多种具有生物活性的次生代谢产物,具有抗肿瘤、杀菌、杀虫、调节植物生长及增强植物抗性等不同作用。而关于桑树中有无内生真菌及其次生代谢产物研究还未见报道。有鉴于此,本文从四个桑树品种中分离内生真菌并进行了相关研究。主要结果如下:1.用组织分离法结合表面消毒有效性评价,从四个桑树品种中共分离出内生真菌114株。经显微形态观察,初步归属为镰孢霉属Fusarium、链格孢属Alternaria、柱霉属Scytalidium等21个属,表明桑树内生真菌具有丰富的生物多样性。研究发现不同桑树品种之间内生真菌的分布有一定的差异,同一桑树品种不同器官内生真菌的种类和数量差异较大,根中最多,茎中次之,叶中最少。镰孢霉属为根中优势种群,链格孢属为茎、叶中的优势种群,丛梗孢属Monilia和镰孢霉属菌株在根、茎、叶中均能分离到,其它属的菌株只存在于其中的某一个或两个器官组织。2.运用显微形态观察和苏丹Ⅲ染色法从桑树内生真菌中筛选出一株产油菌株。用形态学和分子生物学方法鉴定并命名为桑树内生菜豆壳球孢菌MOD-1（Mulberry endophyte Macrophomina phaseolina MOD-1）。菌株的5.8S rDNA/ITS区段序列已在GeneBank中注册,登录号为EU250575。经测定菌体含油量达22.72%,且对纤维素有一定的降解能力。3.用酸热法提取油脂,油脂甲酯化后采用气-质联用仪进行了MOD-1菌株油脂脂肪酸组成的定性分析和相对含量测定。结果表明:MOD-1菌株油脂包含18种脂肪酸,其中不饱和脂肪酸含量为69.88%,主要为反油酸（37.80%）、亚油酸（13.55%）、棕榈油酸（10.71%）、油酸（6.72%）,还有少量的十四碳烯酸、二十碳二烯酸、二十碳四烯酸等不饱和脂肪酸;饱和脂肪酸含量为30.12%,主要为棕榈酸（19.56%）、硬脂酸（8.22%）、花生酸（1.11%）、肉豆蔻酸（0.51%）以及少量的月桂酸、十五烷酸、十七烷酸、山嵛酸等饱和脂肪酸。4.运用光学显微镜、透射电镜技术观察了MOD-1菌株不同发育阶段的油脂形成、积累的过程,并对此菌株油脂的形成机制进行了探讨。结果表明: MOD-1油脂的产生和积累跟菌丝的生长和菌核的分化几乎同步进行;每个细胞的胞质内首先产生大量的嗜锇颗粒、蛋白-脂类复合体;伴随MOD-1菌体细胞的生长发育,细胞内嗜锇颗粒和蛋白-脂类复合体逐渐演变为油脂储存在油滴中,油滴数量不断增加,体积不断增大;发育到一定阶段,嗜锇颗粒、蛋白-脂类复合体消失,菌体细胞充满大小不一的油滴;油脂可以通过两个细胞间的通道相互流动。说明细胞质内的嗜锇颗粒和蛋白-脂类复合体是形成油脂的前体物和各种酶的复合体,油滴既是油脂储存的场所,也是油脂合成的场所之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 植物内生真菌研究进展
• 1.1 植物内生真菌的概念
• 1.2 植物内生真菌的两大生态类群
• 1.3 植物内生真菌存在的普遍性和多样性
• 1.4 植物内生真菌的生物学作用
• 1.5 植物内生真菌有益次生代谢产物的研究
• 1.6 植物内生真菌的侵染与定殖研究
• 1.7 植物内生真菌的鉴定和分类学研究
• 1.7.1 传统的真菌分类方法
• 1.7.2 现代的分子生物学方法
• 2 微生物油脂研究进展
• 2.1 产油微生物及微生物油脂的概念
• 2.2 微生物油脂产生的机理
• 2.3 产油微生物国内外研究进展
• 3 菜豆壳球孢菌 Macrophomina phaseolina 研究概况
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 桑树内生真菌的分离鉴定及其多样性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 桑树品种
• 1.1.2 培养基的配方及制作
• 1.1.3 主要的试剂与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 内生真菌的分离
• 1.2.2 消毒分离有效性评价
• 1.2.3 内生真菌的纯化
• 1.2.4 菌株编号规则
• 1.2.5 菌株鉴定
• 1.2.5.1 观察制片
• 1.2.5.2 诱导产孢
• 1.2.5.3 菌株照相
• 1.2.5.4 观察记录的要点
• 1.2.6 菌种保存
• 2 结果与分析
• 2.1 消毒剂及消毒时间的确定
• 2.2 桑树内生真菌的分离鉴定结果及多样性分析
• 2.3 桑树不同品种不同器官组织内生真菌种群组成分析
• 3 讨论
• 第三章 桑树内生产油菌 Macrophomina phaseolina MOD-1 的筛选与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 仪器与试剂
• 1.1.2.1 主要仪器
• 1.1.2.2 主要试剂及配制方法
• 1.2 方法
• 1.2.1 桑树内生产油菌株的筛选
• 1.2.2 桑树内生真菌MOD-1 纤维素酶活性研究
• 1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 1.2.2.2 纤维素酶活测定方法
• 1.2.3 桑树内生真菌MOD-1 菌株的形态学鉴定
• 1.2.4 桑树内生真菌MOD-1 菌株的分子生物学鉴定
• 1.2.4.1 菌体培养和收集
• 1.2.4.2 DNA 的提取
• 1.2.4.3 PCR 扩增
• 1.2.5 PCR 产物序列测定
• 2 结果与分析
• 2.1 产油菌株的筛选结果
• 2.2 MOD-1 菌株的纤维素降解酶活性
• 2.3 MOD-1 菌株形态学鉴定结果
• 2.4 MOD-1 菌株的分子生物学鉴定
• 3 讨论
• 第四章 桑树内生真菌 Macrophomina phaseolina MOD-1 产油机制的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Macrophomina phaseolina MOD-1 油脂脂肪酸成分的GC-MS 分析
• 1.2.2 Macrophomina phaseolina MOD-1 油脂形成的光学显微镜观察
• 1.2.3 Macrophomina phaseolina MOD-1 油脂形成的透射电镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 MOD-1 菌株油脂脂肪酸组成成分分析
• 2.2 MOD-1 菌株不同发育阶段油脂形成的显微观察
• 2.2.1 MOD-1 菌株不同发育阶段油脂形成的光学显微镜观察
• 2.2.2 MOD-1 菌株不同发育阶段油脂形成的透射电镜观察
• 2.3 MOD-1 菌株油脂的形成
• 3 讨论
• 3.1 关于Macrophomina phaseolina MOD-1 油脂脂肪酸组成
• 3.2 关于MOD-1 菌株油脂前体物的形成
• 3.3 关于脂质体来源及形成机理
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文