论文摘要
研究背景及目的血管生成（angiogenesis）是指活体组织在已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程,是肿瘤生长、浸润和转移过程中最重要的一个环节。肿瘤血管生成是一个多因子参与的多步骤的复杂过程。基础研究表明,肿瘤血管内皮细胞整合素表达差异可能与肿瘤血管生成密切相关。目前,整合素与血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）一样被认为是肿瘤新生血管的特异性标志物,已成为肿瘤诊断和治疗研究的重要靶点。整合素是一组由α和β亚基非共价结合的异二聚体跨膜糖蛋白。迄今为止,在脊椎动物已发现大约有20种整合素,至少由18种α亚基和8种β亚基配对形成。整合素αvβ3（αvβ3受体）是其中一种重要的分子,能够和细胞外基质（extracellular metrix, ECM）中的多种成分如纤维黏连蛋白（fibronectin, FN）、玻璃黏连蛋白（vitronectin, VN）、血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1, TSP-1）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN）和von Willebrand因子（von Willebrand, vWF）等相互作用,这些配体的共同特点是均包含有相同的αvβ3受体识别序列,即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）三肽序列。αvβ3受体与肿瘤血管生成、侵袭转移密切相关,在成熟血管内皮细胞表面整合素呈低水平表达,但在肿瘤新生血管内皮细胞和多种肿瘤细胞表面表达显著上升。由于肿瘤新生血管内皮细胞属于遗传稳定的非恶性内皮细胞,其表面的αvβ3受体不存在突变的可能,加之这些细胞表面直接与循环血液接触,更容易接近药物,使之成为肿瘤治疗合适的靶标。对αvβ3受体拮抗多肽的结构-效应关系研究发现,含有两个二硫键的环形RGD多肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制效力最强,是含单一二硫键环形RGD多肽的20倍,是线形RGD多肽的200倍。此外,含有RGD序列的拮抗肽中环形RGD多肽较线形RGD多肽有更高的αvβ3受体结合亲和力。目前,含RGD序列的小分子多肽已用于恶性肿瘤抗血管生成治疗的II期临床试验。利用放射性核素标记RGD多肽实现αvβ3受体显像及核素靶向治疗也成为肿瘤分子核医学研究的热点之一。我们既往的研究采用诊断性核素99Tcm直接标记RGD-4CK,标记方法简便,放射化学纯度高,体外稳定性好,体内动力学性质优良,该研究提示直接法标记的RGD-4CK是一种很有前景的肿瘤受体显像剂。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,采用核素188Re直接标记法标记RGD-4CK,系统研究188Re标记RGD-4CK的方法、标记物的理化性质及体内示踪动力学、荷瘤动物体内生物分布,为进一步开展188Re-RGD-4CK靶向治疗实体肿瘤的实验研究奠定基础。研究方法1.采用预锡化法直接标记RGD-4CK,3MM色谱纸层析测定放射化学纯度,应用正交试验设计方法筛选最佳标记条件。2.通过HPLC分析,血清蛋白结合和半胱氨酸置换等体外稳定性实验,评价188Re-RGD-4CK的理化性质。3.选取雄性日本大耳兔9只,每只静脉注射37 MBq 188Re-RGD-4CK,分别于1.5, 3.0, 5.0, 10, 30, 60, 90, 120, 180, 360, 600, 1020 min采血、称重并测定血样品放射性计数,结果经参考源校正后以MBq/L表示,所得数据应用DAS 2.0软件处理,结合αvβ3受体在正常体内实际表达情况判断室模型。4.选取荷B16/F10恶性黑色素瘤C57BL/6小鼠25只,随机分为5组（n=5）,每只静脉注射0.74 MBq 188Re-RGD-4CK,分别于0.5, 1, 3, 8, 16 h处死小鼠。采集血液、心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑、肿瘤,称重并测定放射性计数,结果经参考源校正后以每克组织百分注入剂量（%lD/g）表示,计算肿瘤组织与非肿瘤组织放射性计数之比（T/NT）。5.选取雄性日本大耳兔2只,每只静脉注射74 MBq 188Re-RGD-4CK,应用SPECT进行显像,结合感兴趣区（region of interest, ROI）时间-放射性曲线（time-radioactivity curve, T-A curve）分析,观察家兔体内放射性的动态分布变化。实验结果1.根据极差分析得到188Re-RGD-4CK最佳标记条件为:酒石酸钾钠、氯化亚锡、抗坏血酸用量分别为2.83μmol, 4.43μmol, 500μg;预锡化温度、时间和pH值分别为60℃, 4 h和2.5;标记温度和时间分别为95℃, 40 min。该条件下188Re-RGD-4CK的放化纯度96.49%±0.68%（n=8）。2.188Re-RGD-4CK的HPLC保留时间与洗脱液放射峰值时间基本一致,室温放置16 h的放射化学纯度仍>90%;与400 mmol/L半胱氨酸37℃温育l h,未结合188ReO4-仅增加1.56%;188Re-RGD-4CK与血清蛋白无明显结合。3.188Re-RGD-4CK在健康家兔体内的药代动力学符合权重数为1/C2的二室模型,分布相半衰期为0.52 min,消除相半衰期为37.79 min。4.荷B16黑色素瘤C57小鼠血液放射性清除迅速,主要通过泌尿系统排泄,脑、肌肉、骨骼等组织呈低放射性分布。肿瘤组织放射性蓄积在注射后3.0 h达到最大,与肌肉、骨骼的靶/非靶放射性比值最高为3.76。5.家兔SPECT显像示:各组织器官T-A曲线均随时间逐渐下降;l min双肾即显影,5 min心、肝影开始减弱,肺放射性分布均匀,强度低于肝脏,膀胱显影;5 min后膀胱影持续增强,20 min后软组织影逐渐减弱;胆囊未显影,腹部呈持续低放射分布,胃区始终呈放射性缺损,颈部未见明显核素浓聚。结论1.本研究制备的188Re-RGD-4CK方法简便,放射化学纯度高（>95%）,无需分离纯化而直接应用,易于制备成一步法标记冻干药盒。188Re-RGD-4CK的理化性质优良,具有较为理想的体内生物分布和药代动力学行为。2.荷B16黑色素瘤C57小鼠肿瘤组织选择性浓聚188Re-RGD-4CK,并具有αvβ3受体介导结合特性。肿瘤/肌肉的高放射性比值为进一步开展荷瘤动物靶向内照射治疗研究提供了可靠的实验依据。