甘蔗梢腐病病原菌—串珠镰刀菌分子生物学研究初探

论文摘要

串珠镰刀菌（Fusarium moniliformis）引起的甘蔗梢腐病是甘蔗生产过程中一种常见病害。1921在印度尼西亚爪哇首次报道了该病。目前几乎所有甘蔗生产国和地区都有该病发生。并引起了比较的严重的病害,造成了一定的损失（张国棉,2009）。本文研究了该病病原菌串珠镰刀菌的原生质体制备及转化技术。文中对液体高度、离心力、离心管大小、离心机升速与减速的快慢、离心管穴倾角、不同洗涤剂等因素对原生质体活性、沉淀松紧度及壁效应的影响进行了研究；文中还研究了不同复苏时间对原生质体再生的影响,以及不同酶浓度及不同酶对原生质体产率的影响；文中也介绍了一种离心管平衡的方法。为了了解各个基因的各种功能,笔者使用TrpC启动子+hph （Hygromycinphosphtotransferase, hph）)基因的ORF的DNA PCR扩增片段对原生质体进行转化,并对转化子插入位点的侧翼序列进行克隆。共获得三个转化子的插入片段侧翼序列。其它扩增到的侧翼序列则主要为载体上的序列和用于转化的片段间互相搭桥形成的序列。因此用该法进行随机插入仍要求改进。MAPK途径与真菌生长发育、有性生殖、分生孢子产生等相关。丝氨酸蛋白酶是分解蛋白质的酶。病原菌分泌的丝氨酸蛋白酶,可能是病原菌的毒性因子。这两类基因都可能与病原菌致病相关。为了寻找与致病相关基因,本文对串珠镰刀菌的MAPK途径基因和丝氨酸蛋白酶基因进行了研究。通过同源重组进行基因敲除,作者共获得于A149三个MAPK途径基因的敲除突变体。对这些突变体进行表型分析发现：FVEG02618.3敲除突变体生长速度没有变化；菌落形态没有太大变化；对盐分比较敏感；致病性略有下降；产孢没有太大变化。FVEG03043.3的敲除突变体菌落生长明显变慢,为野生型的三分之一；菌落颜色加深；当氯化钠浓度为0.5M时,菌落生长速度较在氯化钠浓度为OM时生长速度加快,但比野生型仍然减慢；分生孢子产生情况没有太大变化：致病性也没有太大变化。FVEG04168.3的敲除突变体生长速度、菌落形态与野生型相比没有差异；突变体的致病性没有变化。分生孢子产生也没有变化。突变体对盐浓度极敏感。在含0.5M的氯化钠下培养基就不生长。作者获得了FN28一个丝氨酸蛋白酶基因FVEG00212.3的敲除突变体。表型分析说明敲除突变体的生长速度没有太大变化,菌落颜色明显加深,气生菌丝明显减少,菌丝易早期死亡,分生孢子产生没有太大变化,致病性也没有太大变化。作者也获得了该基因的过表达突变体。过表达突变体致病性、产孢、菌落形态等都没有太多变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 丝状真菌原生质体制备遗传转化研究进展
• 1.1.1 原生质体的制备的影响因素
• 1.1.1.1 菌丝体的菌龄
• 1.1.1.2 预处理方式
• 1.1.1.3 裂解酶浓度
• 1.1.1.4 培养基成分
• 1.1.1.5 裂解酶的种类
• 1.1.1.6 裂解时间
• 1.1.1.7 裂解温度
• 1.1.1.8 酶液及稳渗剂pH值
• 1.1.1.9 稳渗剂类型
• 1.1.1.10 其他影响因素
• 1.1.2 影响原生质体再生的因素
• 1.1.3 丝状真菌的原生质体转化方法
• 1.1.3.1 电击转化法（Electroporation）
• 1.1.3.2 PEG介导转化法
• 1.1.3.3 醋酸锂（Lithium Acetate）转化法
• 1.1.3.4 根癌农杆菌介导的转化（Agrobacterium tumefaciens MediatedTransformation）
• 1.1.3.5 基因枪转化法（Biolistics）
• 1.1.3.6 限制性内切酶介导转化法（Restriction Enzyme Mediated Integration）
• 1.1.3.7 脂质体转化法
• 1.1.4 丝状真菌遗传转化系统的选择标记
• 1.1.4.1 抗药物性标记
• 1.1.4.2 功能标记
• 1.1.4.3 营养缺陷型标记
• 1.2 病原菌致病相关基因的研究
• 1.2.1 MAPK途径的研究
• 1.2.2 丝氨酸蛋白酶的研究
• 第二章 甘蔗梢腐病菌原生质体制备及遗传转化体系建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 溶壁酶酶浓度对原生质体制备的影响
• 2.2.2 不同酶对原生质体裂解的影响
• 2.2.3 离心力及液体高度对原生质体活性的影响
• 2.2.4 不同高度的液体对沉淀的松紧度的影响
• 2.2.5 同样高度的液体、不同管径离心管对沉淀松紧度的影响
• 2.2.6 不同复苏时间对原生质体再生的影响
• 2.2.7 如何避免将原生质体离心于管壁上
• 2.2.8 不同减速档对于沉淀松紧度影响
• 2.2.9 不同稳渗剂对于原生质体沉淀的影响
• 2.2.10 甘蔗梢腐病菌的潮霉素最佳抑制浓度的筛选
• 2.2.11 离心机的平衡方法
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 随机插入突变体的插入位点侧翼序列扩增的探索及发现
• 3.1 试验使用的菌株、质粒、试剂和培养基等材料
• 3.1.1 菌株
• 3.2 试剂
• 3.3 实验方案
• 3.3.1 镰刀菌基因组DNA的提取
• 3.3.2 DNA琼脂糖电泳
• 3.3.3 几种扩增侧翼的方法
• 3.3.4 测序
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 对扩增插入片段侧翼序列的一些探索
• 3.4.2 侧翼序列扩增结果
• 3.4.3 对扩增已知片段的侧翼序列的方法的探讨
• 3.5 结论与讨论
• 第四章 假定致病相关的基因的功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 原生质体制备与转化,DNA提取、PCR反应
• 4.1.2 Southern blot
• 4.1.3 FN28目的片段的扩增
• 4.1.4 基于同源重组的基因敲除原理
• 4.1.5 基因过表达突变体的获得
• 4.1.6 盐胁迫测定
• 4.1.7 致病性测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 目的片段的扩增
• 4.2.2 串珠镰孢MAPK信号级联相关基因功能分析
• 03043.3'>4.2.2.1 FVEG₀3043.3
• 4.2.2.2 FVEG 02618.3
• 04168.3'>4.2.2.3 FVEG₀4168.3
• 4.2.3 甘蔗梢腐病病原菌丝氨酸蛋白酶的研究
• 4.2.3.1 FVEG00212.3
• 4.3 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢