论文摘要
背景动脉粥样硬化性疾病（Atherosclerosis,AS）是严重危害人类健康的重要疾病之一。关于其发病机制,传统假说认为AS斑块中平滑肌细胞来源于血管中膜平滑肌细胞的迁移和增生,然而最近一系列研究表明AS斑块中平滑肌细胞不仅来自中膜平滑肌细胞,也可能来源于骨髓及外周血祖细胞等。Myocardin是迄今为止所发现的最关键的促血管平滑肌细胞分化因子,仅表达于胚胎发育时期和成年个体的血管等含有平滑肌的组织和心肌组织。若通过腺相关病毒介导RNAi技术阻断myocardin的表达来抑制骨髓干细胞向平滑肌细胞分化,将能够为阐明AS发病机制提供实验依据,也为防治AS提供新思路。目的构建表达小鼠myocardin特异性干扰序列的重组腺相关病毒载体,体外观察其对myocardin的沉默效应及在小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化过程中的影响。方法应用基因重组技术,构建含特异性myocardin mRNA干扰序列的质粒pAAV-MCS-myocardin-siRNA-U6 ,酶切测序鉴定;采用磷酸钙法将该质粒与pAAV-RC、pHelper质粒共转染入HEK293T细胞,包装出重组病毒;同时采用同样的方法包装出重组病毒rAAV-hrGFP和rAAV-LacZ;利用rAAV-LacZ间接测定重组病毒的滴度;重组病毒体外感染血小板源性生长因子（PDGF-BB）诱导的小鼠骨髓间充质干细胞;RT-PCR检测干扰表达效果及平滑肌特异性标志物SM22α、α-SM-actin相应的变化。结果成功构建出重组病毒rAAV-myocardin-siRNA-U6,病毒滴度约为1.5×1010 /ml,重组病毒感染后的诱导的小鼠骨髓间充质干细胞,myocardin mRNA表达下降,同时平滑肌特异性标志物SM22α、α-SM-actin表达下调。结论构建的重组病毒rAAV-myocardin-siRNA-U6有效而特异得抑制了myocardin的表达,并对小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化起到抑制作用。说明myocardin在诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的过程中起关键作用。
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