启动子区重新甲基化对c-myc和H-ras基因表达和肿瘤细胞生长的影响

论文摘要

目的：利用甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-mcthionin，SAM）使恶性肿瘤细胞系MGC803、HT29中癌基因c-myc和H-ras启动子区域的CpG岛重新甲基化，研究甲基化对癌基因的转录调控作用及其对肿瘤细胞系生长增殖的生物学影响，寻找抗癌治疗的新靶点，为肿瘤的临床诊断和治疗提供准确灵敏的实验基础和理论依据。方法：传代培养胃癌细胞系MGC803、大肠癌细胞系HT29及人正常肝脏细胞系（Chang liver cell line），分别随机选取一部分培养物用SAM处理，作为实验组（记为T1、T2、T3）；剩余部分不经过药物处理作为对照组（记为C1、C2、C3）。首先运用MTT法绘制细胞生长曲线，计算细胞生长抑制率，比较SAM对各组细胞的抑制作用；分别提取各组细胞的基因组DNA，经甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation-specific PCR，MSP）检测目的基因c-myc和H-ras的甲基化状态，确定其启动子区域的CpG岛是否被甲基化；然后分别提取各组细胞的总RNA，以GAPDH为内参，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR（Real Time RT-PCR）扩增目的基因和GAPDH，检测实验组与对照组间目的基因mRNA的表达变化；最后以免疫细胞化学染色和荧光染色检测目的基因蛋白表达的变化。结果：1．MTT法：由细胞生长曲线可见，对于肿瘤细胞系MGC803、HT29，实验组与对照组相比，肿瘤细胞的生长受到明显的抑制；而正常细胞系的实验组与对照组相比，药物对细胞生长的抑制作用不显著。计算细胞生长抑制率可知，肿瘤细胞系的生长抑制率（22.0％、20.3％）与正常细胞系（6.8％）比较明显增大，差异有统计学意义（P＜0.05）。2．MSP法：对于肿瘤细胞系MGC803和HT29，未经SAM处理的对照组（C1、C2）中肿瘤细胞癌基因启动子区域的CpG岛表现为非甲基化，由非甲基化引物对扩增出；而经过SAM处理的实验组（T1、T2）中两个癌基因启动子区域的CpG岛均发生甲基化，由甲基化引物对扩增出。正常细胞系的实验组与对照组（T3、C3）无明显差异，其癌基因启动子区域CpG岛均呈现高甲基化状态。3．RT-PCR和Real Time RT-PCR：肿瘤细胞系实验组中癌基因c-myc和H-rasmRNA的表达量与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而正常细胞系实验组与对照组中c-myc与H-ras的mRNA表达无明显差异（P＞0.05）。在没有SAM干预的情况下，癌基因c-myc和H-ras在肿瘤细胞系中的表达均高于正常细胞系，差异有统计学意义（P＜0.05）。4．免疫细胞化学染色和荧光染色：经过SAM处理后，肿瘤细胞系中的c-myc与H-ras蛋白的表达与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常细胞系的实验组与对照组中c-myc与H-ras基因蛋白的表达无明显差异（P＞0.05）。结论：癌基因c-myc与H-ras的启动子区在正常细胞中处于高甲基化状态，在肿瘤细胞中呈现低甲基化而过量表达，提示其可作为肿瘤诊断的生物学标记和检测靶点。利用增加甲基供体的方法可以有效地使肿瘤细胞中低甲基化的癌基因启动子重新甲基化，影响其转录活性，抑制癌基因表达，从而抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤的临床治疗提供了新的思路和方法。

论文目录

• 英文缩略语（Abbreviation in English）
• 中文摘要（Abstract in Chinese）
• Abstract
• 前言（Preface）
• 实验流程图（experimental flow graph）
• 材料与方法（Materials and methods）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 致谢（Acknowledgement）