家蚕新基因BmEm4的克隆，表达与功能研究

论文摘要

果蝇中的剪切增强子m4基因E（spl）m4是受到microRNA调控的靶基因,它通过参与Notch信号途径来调节果蝇的神经发育,而目前关于家蚕的Notch信号途径及其相关蛋白的研究仍然是一片空白。我们通过RT-PCR的方法从家蚕中克隆得到果蝇E（spl）m4的同源基因命名为BmEm4[Bombyx mori E（spl）m4],GenBank登录号为FJ436408。该基因ORF框大小为477bp,编码158个氨基酸,预测分子量为18.01KD。通过生物信息学分析发现该基因3’非编码区含有一些高度保守的模体（例如Brd盒子,GY盒子,K盒子和CAAC模体）和两个潜在的microRNA结合位点。我们将扩增到的BmEm4基因克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到融合蛋白表达质粒pET-28a-BmEm4,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,在24 kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带以包涵体的形式表达,与预期值（融合标签3.56 kDa,BmEm4 18.01 kDa）基本相符,经质谱鉴定正确。我们用Ni柱亲和层析的方法纯化带有His标签的融合蛋白,将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰兔制得多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:25600以上。我们用该抗体来检测该蛋白的组织分布和亚细胞定位。通过免疫印迹、免疫组化和实时荧光定量PCR试验发现BmEm4在家蚕不同发育时期的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显不一致。我们通过Western blotting和免疫组化发现该蛋白在家蚕发育各时期中蛹和幼虫时的表达量较高,而在卵和蛾中很难检测到表达。但是荧光定量PCR结果显示该基因在卵时期的mRNA水平最高,这与该时期很难检测到蛋白表达相矛盾。另外BmEm4蛋白在第三天的五龄幼虫的头部、表皮、肠、气管以及快要吐丝的五龄幼虫的卵巢中都有表达,其中头部表达量最高,而在脂肪体、睾丸、马氏管和丝腺中很难检测到表达,各个组织的mRNA水平和蛋白水平基本一致。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在细胞质中。我们推测BmEm4和果蝇E（spl）m4基因的功能相似,在家蚕的神经发育过程中起着重要作用并有可能受到microRNA的调控。此外,我们还用梯度浓度的Notch信号途径阻断剂DAPT处理家蚕BmN细胞,之后提取细胞的总RNA和总蛋白,用荧光定量PCR和Western blotting的方法检测BmEm4基因的转录和表达水平变化。结果显示,随着处理浓度的增加,BmEm4基因的转录和表达水平均呈现下降的趋势。我们推测家蚕BmEm4基因是Notch信号途径下游的靶基因,其表达受到Notch信号途径的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 剪切增强子复合体蛋白研究进展
• 1 Notch 信号途径
• 2 Notch 信号途径与疾病的关系
• 3 E（spl）m4 蛋白
• 4 E（spl）m4 蛋白的研究展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程
• 3.1 原核表达及抗体制备
• 3.2 家蚕中BmEm4 的转录水平和翻译水平分析
• 3.3 与Notch 信号途径相关的功能研究
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学工具
• 2 方法
• 2.1 BmEm4 基因的序列分析
• 2.2 BmEm4 基因的序列受microRNA 调控位点的分析
• 3 结果
• 3.1 BmEm4 基因的序列
• 3.2 BmEm4 蛋白高级结构的预测
• 3.3 BmEm4 蛋白定位的预测
• 3.4 BmEm4 基因的同源性和保守序列分析
• 3.5 BmEm4 基因潜在microRNA 结合位点的分析
• 4 讨论
• 第四章 BmEm4 的原核表达与抗体制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 BmEm4 基因的克隆
• 2.2 BmEm4 基因序列的测定
• 2.3 重组质粒的转化及鉴定
• 2.4 重组质粒在大肠杆菌（BL21）中的表达
• 2.5 表达情况的SDS-PAGE 电泳分析
• 2.6 融合蛋白的纯化
• 2.7 抗体的制备
• 2.8 抗体的纯化
• 2.9 抗体效价的测定
• 3 结果
• 3.1 家蚕蛹总RNA 琼脂糖电泳检测
• 3.2 RT-PCR 扩增完整的ORF 框
• 3.3 重组质粒pET-28a-BmEm4 的鉴定
• 3.4 重组质粒的测序结果
• 3.5 重组质粒的诱导表达及纯化
• 3.6 抗体的纯化
• 3.7 抗体的效价测定
• 4 讨论
• 第五章 Bm Em4 的表达分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 家蚕总RNA 的提取
• 2.2 荧光定量PCR 引物的设计
• 2.3 荧光定量PCR
• 2.4 荧光定量PCR 数据分析
• 2.5 家蚕总蛋白质的提取及定量
• 2.6 Western blotting 检测BmEm4 蛋白的分布
• 2.7 家蚕冰冻切片的制作
• 2.8 免疫荧光染色
• 3 结果
• 3.1 家蚕发育过程中BmEm4 基因的转录水平分析
• 3.2 家蚕发育过程中BmEm4 蛋白表达量的变化
• 3.3 五龄幼虫各个组织中BmEm4 转录水平的分析
• 3.4 五龄幼虫各个组织中蛋白表达量分析
• 3.5 BmEm4 在家蚕幼虫中的组织分布
• 3.6 BmEm4 在家蚕蛹中的组织分布
• 4 讨论
• 第六章 亚细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第七章 与Notch 信号途径相关的研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 2 方法
• 2.1 BmN 细胞的传代培养
• 2.2 不同浓度DAPT 处理BmN 细胞
• 2.3 细胞RNA 的提取与逆转录反应
• 2.4 荧光定量PCR
• 2.5 细胞总蛋白的提取
• 2.6 Western Blotting 分析
• 3 结果
• 3.1 不同浓度DAPT 处理24 h 后BmEm4 基因的转录水平变化
• 3.2 不同浓度DAPT 处理24 h 后BmEm4 基因的表达水平变化
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的论文