论文摘要
尽管是机体必需的微量元素,锰更多的是因其急性高浓度或长期低剂量的暴露导致不可逆的神经系统毒性而受到关注。生产工艺的改进及劳保措施的完善使得高浓度的职业锰暴露渐渐不再占据主导地位,而随着交通工具的平民化,含锰抗爆汽油消耗剧增直接导致汽油燃烧后排放到大气中各种含锰烟尘增加,农业上含锰农药的推广,医疗…普通人群的环境锰暴露范围在扩大,累积暴露剂量在增长。流行病学调查认为锰暴露累积剂量的增加与帕金森氏症的发病率正相关。暴露方式与剂量的变化直接影响了发生的结果,锰诱导出现严重的锥体外系症状已似乎不再,更多的是早期神经精神症状,如头疼、嗜睡、神经衰弱、认知能力降低、食欲减退等非特异性且易被忽视的综合症。因此,建立锰暴露动物模型探讨神经精神症状有助阐明其早期神经毒机理。具有广泛生物学功能的条件必须氨基酸—牛磺酸是哺乳动物神经系统中含量仅次于谷氨酸的游离氨基酸,大量的研究认为,牛磺酸能促进神经细胞的增殖、分化及延缓神经细胞衰老,影响中枢神经系统神经递质分泌及某些肽类物质含量,调节细胞钙稳态,保护神经细胞免受多种化学物质损伤等作用而发挥健脑益智功能,现今已在临床用于早老性痴呆、各种急慢性脑病的预防与治疗。本课题组前期的研究也观察到牛磺酸改善慢性染锰诱导的大鼠学习记忆障碍,该作用可能与牛磺酸保护海马神经细胞免受锰诱导细胞凋亡有关,但牛磺酸对于暴露早期出现的神经精神症状的干预效果及其机理尚有待完善。因此,本研究将建立急性、亚慢性染锰动物模型,通过Morris水迷宫观察大鼠的学习记忆变化,测定红细胞锰浓度,海马组织胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶的活力以指示乙酰胆碱的代谢变化,进一步采用免疫组织化学方法观察发出胆碱能神经纤维到海马的基底前脑胆碱能神经元的形态、数量变化,最后采用蛋白质组学技术寻找海马在不同状态下的差异表达蛋白质,并对部分鉴定的差异蛋白作蛋白、基因表达水平的进一步验证,同时对牛磺酸预防及治疗的效果进行观察。方法一牛磺酸对锰诱导大鼠空间学习记忆损伤的干预研究急性染毒:100只SPF雄性SD大鼠随机分5组,分别为:生理盐水（NS）对照组（C）,连续ip0.9%NS,实验期限为4w;染锰Ⅰ组（M1）,每日ip MnCl2.4H2O（15mg /kg.d）,连续4w;牛磺酸预防组（P）,染锰的同时ip牛磺酸（200mg /kg.d）,持续4w;牛磺酸治疗组（T）,染锰4w结束后再ip牛磺酸200mg /kg.d,治疗4w,即ip MnCl2.4H2O 28d+ip牛磺酸28d,时长8w;染锰Ⅱ组（M2）,染锰4w结束后再ip NS 4w,即ipMnCl2.4H2O 28d+ip NS 28d,实验期共8w。亚慢性染毒:各组染毒剂量及频率不变,时长则延长一倍,即染毒总时长C、M1、P为8w,T及M2则为16w（8w+8w）。上述两亚组大鼠分别在最后一次干预结束后24h进行水迷宫实验,分别以头5天平均逃避潜伏时间及第六天的平台搜索次数评估大鼠空间学习能力及空间记忆能力的变化。二牛磺酸对染锰大鼠红细胞锰、铁含量的干预研究两亚组动物完成水迷宫后颈椎脱臼处死,迅速开胸采心脏血,抗凝剂抗凝后离心去除白细胞及血浆蛋白,分离红细胞,消化后电感耦合等离子发光仪测定各组红细胞的锰负荷及铁含量,反映红细胞锰含量作为锰暴露早期观察指标的稳定性及与之密切相关的铁含量的变化。三牛磺酸对染锰大鼠海马乙酰胆碱代谢变化的干预研究分离各组动物的海马组织,制备组织匀浆液,测定乙酰胆碱合成、分解的两个关键酶—胆碱乙酰转移酶及乙酰胆碱酯酶活力以指示海马组织中乙酰胆碱代谢的变化,探讨牛磺酸对急性、亚慢性染锰改变此两酶活力与学习记忆能力影响之间的关系。四牛磺酸对染锰大鼠基底前脑胆碱能神经细胞的干预研究各染毒组动物灌注固定后切片行免疫组化染色,观察基底前脑胆碱乙酰转移酶阳性神经细胞形态及数量变化,探讨染锰及牛磺酸干预对基底前脑乙酰胆碱能细胞影响及其与学习记忆的关系。五牛磺酸对染锰大鼠海马毒性干预作用的蛋白质组学研究各染毒动物分离海马组织,制备总蛋白进行二维电泳分离蛋白,经软件比对选择差异表达的蛋白质点进行鉴定,探讨牛磺酸干预对染锰诱导海马神经毒性的特异靶蛋白。六牛磺酸干预对急性染锰大鼠海马部分差异蛋白质的表达研究采用蛋白免疫印迹及相对荧光定量PCR选择感兴趣的差异蛋白进一步进行蛋白及分子表达水平的验证。结果一牛磺酸对锰诱导大鼠空间学习记忆损伤的干预研究1牛磺酸对急性染锰诱导大鼠空间学习记忆损伤的干预研究水迷宫实验结果表明:染锰Ⅰ组大鼠平均逃避潜伏时间（39.8±2.3） s较对照组（29.5±2.5）s及牛磺酸预防组（29.4±2.3）s显著延长（P<0.05）,染锰Ⅱ组（56.6±3.0）s与牛磺酸治疗组（27.8±2.3）s相比显著延长（P<0.05）,平台搜索次数染锰Ⅰ组（3.2±3.2）较对照组（4.5±3.5）有降低趋势,牛磺酸预防（5.7±3.1）显示出上调染锰所致平台搜索次数减少的趋势,与染锰Ⅱ组（6.1±2.0）相比,牛磺酸治疗组（4.8±3.3）的平台搜索次数反而减少,但各组间差异无统计学意义。2牛磺酸对亚慢性染锰诱导大鼠空间学习记忆损伤的干预研究水迷宫实验结果反映平均逃避潜伏时间染锰Ⅰ组（53.6±4.3）较对照组（38.5±4.3）及牛磺酸预防组（38.6±4.3）显著延长（P<0.05）,牛磺酸治疗组（39.1±3.5）与较染锰Ⅱ组（56.0±3.8）显著缩短（P<0.05）,平台搜索次数染锰Ⅰ组（2.0±2.1）较对照组（7.5±4.3）及牛磺酸预防组（6.5±3.6）显著降低（P<0.05）,牛磺酸治疗组（2.5±2.6）与染锰Ⅱ组（5.4±3.1）相比无显著差异。二牛磺酸对染锰大鼠红细胞锰、铁含量的干预研究4w染锰Ⅰ组大鼠红细胞锰含量（0.158±0.017） mg/L较对照组（0.090±0.006）mg/L显著增高,牛磺酸预防（0.154±0.023）mg/L并未显示出有降低红细胞锰含量的效果,其锰负荷依然显著高于对照组,牛磺酸治疗组（0.099±0.016）mg/L与染锰Ⅱ组（0.094±0.011）mg/L相比红细胞锰含量无差异。8w染锰Ⅰ组大鼠红细胞锰（0.134±0.015） mg/L依然高于对照组,牛磺酸预防（0.127±0.021）mg/L也未改变红细胞锰负荷状态,仍然显著高于对照组。与染锰Ⅱ组（0.087±0.006）mg/L相比,牛磺酸治疗组（0.078±0.006）mg/L红细胞锰含量显著降低。然而,红细胞铁含量在急性、亚慢性染毒及牛磺酸干预各组中并未观察到改变。三牛磺酸对染锰大鼠海马组织乙酰胆碱代谢变化的干预研究1牛磺酸对急性染锰大鼠海马组织乙酰胆碱代谢变化的干预研究染锰Ⅰ组海马组织乙酰胆碱酯酶活力（0.63±0.16） （U/mgprot）与空白对照组（0.65±0.11） （U/mgprot）相比无显著差异,但预防组酶活力（0.23±0.06） （U/mgprot）较之对照组及染锰Ⅰ组则显著下降（P<0.05）,染锰Ⅱ组（0.21±0.07） （U/mgprot）较治疗组（0.44±0.12） （U/mgprot）显著降低（P<0.05）;与对照组比较（24.2±2.5） （IU/g）,染锰Ⅰ组（18.0±9.9）（ IU/g）、牛磺酸预防组（18.9±4.5）的海马组织乙酰胆碱转移酶活力稍有降低但并不明显（P>0.05）,牛磺酸治疗组（31.2±10.3）（IU/g）该酶活力则较染锰Ⅱ组（21.16±8.6）（IU/g）显著上调（P<0.05）。2牛磺酸对亚慢性染锰大鼠海马组织乙酰胆碱代谢变化的干预研究染锰Ⅰ组海马组织乙酰胆碱酯酶活力（0.40±0.26） （U/mgprot）与空白对照组（0.29±0.10） （U/mgprot）相比有上升趋势但无统计学差异,牛磺酸预防（0.20±0.04） （U/mgprot）明显下调海马组织中乙酰胆碱酯酶活力（P<0.05）,治疗组（0.25±0.06）乙酰胆碱酯酶活性较（U/mgprot）染锰Ⅱ组（0.34±0.03） （U/mgprot）显著降低。染锰Ⅰ组海马组织乙酰胆碱转移酶活力（13.24±5.09） （IU/g）较对照组（30.27±9.47） （IU/g）显著降低,牛磺酸预防（20.88±9.50）（IU/g）有上调锰抑制的乙酰胆碱移酶活力趋势,但并无显著效果。牛磺酸治疗（31.77±4.60）（IU/g）能显著增加乙酰胆碱转移酶活力（P<0.05）。四牛磺酸对染锰大鼠基底前脑胆碱能神经细胞的干预研究1牛磺酸对急性染锰大鼠基底前脑（vDB/HDB）胆碱能神经细胞的干预研究与对照组vDB/hDB（167.17±14.08 /150.00±9.86）相比,染锰Ⅰ组vDB/hDB （97.00±11.87/ 83.67±3.61）ChAT阳性细胞数量显著减少（p﹤0.05）,牛磺酸预防vDB/hDB （168.50±17.89/115.67±8.98）显著增加染锰诱导减少的ChAT阳性细胞（p﹤0.05）,vDB数量甚至可及正常对照组,hDB尽管也显著高于染锰Ⅰ组,但仍显著低于对照组（p﹤0.05）;与染锰Ⅱ组vDB/hDB（144.5±12.29/120.33±8.16）相比,牛磺酸治疗显著增加vDB （163.17±10.50）ChAT阳性细胞（p﹤0.05）,但hDB（116.17±16.13）无显著差异（p﹥0.05）。2牛磺酸对亚慢性染锰大鼠基底前脑（vDB/hDB）胆碱能神经细胞的干预研究与对照组vDB/hDB（245.0±57.37 /184.50±32.09）相比,染锰Ⅰ组vDB/hDB （188.00±26.63/ 115.17±20.88）ChAT阳性细胞数量显著减少（p﹤0.05）,牛磺酸预防vDB/hDB （167.40±39.81/189.80±48.71）仅能显著增加hDB染锰诱导减少的ChAT阳性细胞（p﹤0.05）,而vDB甚至无显性低于染锰组,并显著低于对照组（p﹤0.05）;牛磺酸治疗组vDB/hDB（156.40±14.19/195.60±35.54）ChAT阳性细胞在vDB显著低于染锰Ⅱ组的相应区域（265.67±49.64） （p﹤0.05）,但hDB（116.17±16.13）则与染锰Ⅱ组相应区（165.33±33.24）无显著差异（p﹥0.05）。五牛磺酸对染锰大鼠海马毒性干预作用的蛋白质组学研究1牛磺酸对急性染锰大鼠海马毒性干预作用的蛋白质组学研究各组凝胶蛋白经发现,对照组观察到（1108±89）个蛋白点,染锰Ⅰ组观察到（1005±140）个蛋白点,牛磺酸预防组观察到（1218±204）个蛋白点,染锰Ⅱ组观察到（1130±151）个蛋白点,牛磺酸治疗组观察到（1099±163）个蛋白点,对照组—染锰Ⅰ组（C-M）匹配后发现46个差异点,染锰Ⅰ组—牛磺酸预防组（M1-P）匹配后发现46个差异点,染锰Ⅱ组—牛磺酸治疗组（M2-T）匹配后发现29个差异点,各差异点表达变化量≥2倍以上。选择上述差异点进行鉴定,经肽指纹图谱（PFT）及串联质谱鉴定了35（35/46）、13（13/29）、17（17/21）各蛋白质。C-M1组的35个差异蛋白中涉及能量代谢、细胞骨架蛋白、核酸代谢、蛋白代谢、信号转导、囊泡转运、氧化调节、胞吞作用及新发现的蛋白,M1-P组的13个差异蛋白包含能量代谢、细胞骨架、细胞骨架调节蛋白、中间蛋白、分子伴侣、氧化调节蛋白等,M2-T组的17个差异蛋白涉及能量代谢、细胞骨架、细胞骨架调节、蛋白调节与代谢、脂质代谢、分子伴侣、囊泡运输、胞吞调节、神经发育于分化及新发现的蛋白等。2牛磺酸对亚慢性染锰大鼠海马毒性干预作用的蛋白质组学研究各组凝胶经图像分析发现,对照组观察到（997±110）个蛋白点,染锰Ⅰ组观察到（1008±94）个蛋白点,牛磺酸预防组观察到（1107±185）个蛋白点,染锰Ⅱ组观察到（1201±147）个蛋白点,牛磺酸治疗组观察到（1312±179）个蛋白点,对照组—染锰Ⅰ组（C-M1）匹配后发现12个差异点,染锰Ⅰ组—牛磺酸预防组（M1-P）匹配后发现8个差异点,染锰Ⅱ组—牛磺酸治疗组（M2-T）匹配后发现17个差异点,各差异点表达变化量≥2倍以上。选择上述差异点进行鉴定,经肽指纹图谱（PFT）及串联质谱鉴定了8（8/12）、2（2/8）、4（4/17）个蛋白质,C-M1的8个蛋白涉及酶、细胞骨架、氧化还原调节、钙调家族、胞吐作用调节、激素刺激调节等,M1-P组两个已鉴定蛋白分别是prepro-A-type allatostatin及胶原纤维酸性蛋白,M2-T组4个蛋白涉及细胞骨架、细胞粘附及蛋白去折叠。六牛磺酸干预对急性染锰大鼠海马部分差异蛋白质的表达研究染锰Ⅰ组及牛磺酸预防组HSP7的表达量较对照组小幅升高,但无差异;治疗组与染锰Ⅱ组间亦无差异。染锰Ⅰ组Prx3较对照组降低,牛磺酸预防或治疗组Prx3的表达量稍低于相同染毒时长的染锰组,但各组间差异无统计学意义（P>0.05）。对照组、染锰Ⅰ组及牛磺酸预防组间HSP7 mRNA表达无显著差异（P>0.05）,而治疗组HSP7mRNA显著高于染锰Ⅱ组;染锰后Prx3mRNA表达降低,牛磺酸预防或治疗对该基因表达与同时长染锰组相比无差异（ P>0.05）;染锰Ⅰ组NDUFS1mRNA表达较对照组低,牛磺酸预防提高该基因表达,但差异不显著（P>0.05）,治疗组mRNA表达显著高于染锰Ⅱ组（P<0.05）。结论1、牛磺酸预防或治疗可改善急性、亚慢性染锰诱导的学习记忆障碍。2、牛磺酸可通过调节胆碱能系统而影响急性、亚慢性染锰诱导的学习记忆障碍。3、蛋白质组学实验揭示急性、亚慢性染锰诱导的海马依赖学习记忆障碍与多种蛋白有关,这些蛋白大多反映线粒体及细胞骨架状态且是牛磺酸干预的调节蛋白。
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