蒙古绵羊皮肤毛囊细胞凋亡的研究

论文摘要

细胞凋亡是多细胞有机体调节发育的一个重要特征,是指细胞在内、外因子的严格控制下,一种有步骤、有活性的生理性自行消亡的过程。毛囊是一个解剖结构较为复杂的器官,其最显著的特点为周期性再生。在哺乳动物的一生中,毛囊反复周期性地经历生长期、退行期和休止期的过程。Seiberg等人在前人工作的基础上,结合自己的研究结果,提出毛发周期与细胞凋亡有关,认为生长期、静止期和退化期三个阶段均伴有细胞凋亡。本研究利用H·E染色、DNA原位末段标记、透射电子显微镜、免疫组织化学法和荧光实时定量PCR技术,对不同季节绵羊皮肤组织结构、表皮层真皮层厚度、凋亡细胞分布、Bcl-2∕Bax蛋白表达,以及Bcl-2∕Bax mRNA表达的变化规律进行了研究,以期进一步了解毛囊生长周期与细胞凋亡的关系,季节变化与细胞凋亡的关系,以及毛囊中细胞凋亡的规律。研究结果如下:1.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊形态的变化（1）首先,通过常规H·E染色观察发现,蒙古绵羊的皮肤结构在各季节基本一致,只是皮肤厚度随季节变化而改变。6批样品中,6月份样品的表皮层是一年中最薄的,12月份样品最厚;8月份样品的真皮层是一年中最薄的,10月份样品最厚。通过对各批样品H·E切片表皮层及真皮层厚度平均值的分析发现,蒙古绵羊的皮肤表皮层厚度变化是连续的,而且与季节周期有密切关系。真皮层厚度对季节变化的影响比较敏感。（2）然后,通过原位末端标记TUNEL染色发现,蒙古绵羊皮肤中的凋亡细胞主要存在于毛囊中,毛囊细胞的凋亡在毛囊生长的各个时期都存在,凋亡细胞的数量和凋亡程度因季节而变化。蒙古绵羊皮肤的凋亡指数最高的在6月份,最低的在10月份,呈现一种先升高再降低又升高的倒S型变化趋势。表皮的厚度则与凋亡细胞数呈相反关系,4月份起开始变薄,56月份为最薄。这种变化规律与家畜毛被季节性脱换时间相吻合。（3）最后,利用透射电子显微镜技术发现,蒙古绵羊皮肤表皮颗粒层中,细胞凋亡并不常见,不同季节中,其超微结构无明显差异。2.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊凋亡Bcl-2/Bax蛋白的变化（1）首先,通过免疫组织化学实验发现,绵羊皮肤组织Bcl-2表达阳性细胞率在12月份最高,6月份最低;随着月份的延伸,Bcl-2阳性细胞率数呈现先下降后上升的V型曲线特点。（2）然后,免疫组织化学实验结果表明,绵羊皮肤组织Bax表达阳性细胞率随着月份的更替呈现先增加,在6月份达到最高后又逐渐减少的钟形曲线。Bax表达高峰与Bcl-2表达低谷同时出现在6月份,说明凋亡高峰可能出现在这一时期。（3）最后,绵羊皮肤组织表达阳性细胞率Bcl-2/Bax蛋白表达比值随着月份的延伸,呈现先陡降后缓慢上升的V型曲线特点,4月份最高,6月份最低——凋亡高峰也出现在这一时期。这说明在皮肤的衰退期、生长期和静止期,Bcl-2和Bax的表达呈反比关系,是一对正负凋亡调节基因。前者具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存周期、使细胞的积累率增加的功能;后者不仅本身能够诱导细胞凋亡,并且可以与前者一起调控细胞凋亡。3.不同季节中蒙古绵羊皮肤毛囊Bcl-2/Bax mRNA表达的变化（1）首先,通过实时荧光定量PCR发现,Bcl-2 mRNA表达在整个毛囊生长过程中,与免疫组化实验中Bcl-2蛋白表达基本一致,同时与末端标记实验中凋亡细胞在6-8月份增加,10-12月份减少的规律也基本一致。说明Bcl-2 mRN的表达对Bcl-2蛋白表达和细胞凋亡具有显著作用。（2）然后,实时荧光定量PCR结果表明,整个毛囊生长周期中,Bax基因mRNA表达呈波浪状的动态平衡,与免疫组化实验中Bax蛋白的表达基本没有相关性,这表明Bax基因mRNA表达和蛋白水平并不同步。（3）最后,通过对实验数据的分析发现,Bax蛋白的表达与Bcl-2蛋白的表达呈反比关系,这说明细胞凋亡的调控主要通过Bcl-2基因来完成,Bax基因则通过对Bcl-2基因的调节,间接调控细胞的凋亡过程。Bcl-2与Bax之间相互制约、相互影响,从而保持一个相对稳定调控。本研究通过H·E染色、原位末端标记、电镜观察、免疫组织化学,以及实时荧光定量PCR实验等多种检测手段,得到了相一致的结果。研究结果充分表明:细胞凋亡与Bcl-2和Bax的表达有关,Bax基因表达促进细胞凋亡,Bcl-2和Bax的表达在细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用。这为进一步深入研究bcl-2/baX基因在细胞凋亡过程中的可能作用及调控机理,打下了理论基础。对于研究家畜绒毛整个周期中毛囊细胞凋亡与绒毛生长、脱落的关系,Bcl-2/Bax表达和毛囊细胞凋亡的联系,以及揭示羊绒毛生长退化机理,进一步开发人为调控羊绒毛生长与退化技术,具有一定理论价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 关于细胞凋亡
• 1.1.1 细胞凋亡的特征
• 1.1.2 细胞凋亡、坏死与程序化死亡（PCD）
• 1.1.3 细胞凋亡的分子机制
• 1.1.4 影响细胞凋亡的因素
• 1.1.5 细胞凋亡的检测方法
• 1.1.6 细胞凋亡的意义
• 1.2 BCL-2 基因家族的研究进展
• 1.2.1 Bcl-2 蛋白的分布
• 1.2.2 Bcl-2 基因家族及其相关蛋白的生物学特性
• 1.2.3 Bcl-2 基因家族蛋白对细胞凋亡的调控
• 1.3 绵羊皮肤结构的研究及其随季节的变化
• 1.3.1 蒙古绵羊皮肤毛囊的组织结构
• 1.3.2 蒙古绵羊毛囊细胞生物学特点
• 1.4 羊毛生长调控的相关因子及作用机制
• 1.4.1 羊毛生长与遗传对羊毛生长的调控
• 1.4.2 羊毛生长相关因子作用机制
• 1.4.3 毛囊生长周期分子水平的调节的研究进展
• 1.5 细胞凋亡在皮肤组织中的研究现状
• 1.5.1 毛囊细胞凋亡研究的历史沿革
• 1.5.2 对毛囊细胞凋亡过程中基因表达作用的研究
• 1.5.3 对毛囊细胞凋亡过程中Bcl-2/Bax 蛋白表达作用的研究
• 1.6 问题的提出
• 2 蒙古绵羊皮肤毛囊细胞凋亡的形态学研究
• 2.1 不同季节蒙古绵羊皮肤毛囊形态H·E 染色研究
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.3 讨论
• 2.2 不同季节蒙古绵羊皮肤毛囊凋亡细胞TUNEL 染色研究
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.3 讨论
• 2.3 蒙古绵羊皮肤毛囊超微结构电镜观察
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 结果与分析
• 2.3.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 蒙古绵羊皮肤毛囊细胞凋亡和BCL-2/BAX 蛋白表达随季节变化的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 免疫组织化学结果判定标准
• 3.1.4 实验数据及处理方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同月份绵羊皮肤组织Bcl-2 表达结果
• 3.2.2 不同月份绵羊皮肤组织Bax 表达结果
• 3.2.3 Bcl-2/Bax 比值的变化规律
• 3.2.4 不同月份绵羊皮肤组织Bcl-2 和Bax 蛋白的表达变化曲线比较
• 3.3 讨论
• 3.3.1 从Bcl-2 和Bax 蛋白表达结果看皮肤毛囊的细胞凋亡
• 3.3.2 Bcl-2 蛋白的表达在不同季节的变化
• 3.3.3 Bax 蛋白的表达在不同季节的变化
• 3.3.4 Bcl-2、Bax 蛋白表达在不同季节变化的关系
• 3.3.5 Bcl-2/Bax 蛋白表达的比值在不同季节变化的关系
• 3.4 小结
• 4 蒙古绵羊皮肤毛囊细胞凋亡和BCL-2 /BAX MRNA 表达随季节变化的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 总RNA 电泳检测
• 4.2.2 实时荧光定量PCR 检测bcl-2、baX mRNA 方法的确定
• 4.2.3 统计分析结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 Bcl-2 m RNA 的表达与季节变化的关系
• 4.3.2 Bax mRNA 的表达与季节变化的关系
• 4.3.3 不同月份蒙古绵羊皮肤毛囊bcl-2 m RNA 与bax mRNA 表达变化曲线的比较
• 4.4 小结
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介